Аннотация:Биолюминесцентная система светляков основана на функционировании фермента люциферазы, принимающая конформацию, необходимую для специфического катализа реакции многоступенчатого окисления кислородом воздуха люциферина светляков:D-Люциферин + О2 + АТР + Мg2+ Оксилюциферин + АМР + РРi + hν (λ = 540—620 нм), где PPi — неорганический пирофосфат.В данной работе для создания биолюминесцентного сенсора, предназначенного для изучения кинетики и механизма действия антибактериальных агентов, мы использовали живые клетки E. coli, продуцирующие рН-резистентную термостабильную люциферазу светляков (Luc), которая полностью сохраняет активность при 37 ⁰С и рН выше 6,0. Внешние стимулы физической и химической природы могут влиять на функционирование и рост живых микроорганизмов, резко изменяя содержание внутриклеточных маркеров АТР и Luc. Минимальные определяемые концентрации АТР и Luc составляют ~10–13 М, что дает возможность быстро регистрировать малейшие изменения их уровня даже в очень разбавленных клеточных суспензиях. Изучение кинетики изменения АТР и Luc внутри и вне клеток в присутствии внешних эффекторов уже на начальной стадии процесса позволяет наблюдать за изменением жизнеспособности и численности микроорганизмов, скорости трансляции белков и проницаемости клеточной мембраны. Проведено сравнение антибиотиков полимиксинового ряда и аминогликозидов на клетки E.coli, которое показало, что полимиксины проявляют мощный бактерицидный эффект, воздействуя прежде всего на АТР-синтазу - наблюдалось резкое снижение АТРin до нулевых значений, а также накопление Lucex вне клеток, что свидетельствует о протекании необратимых изменений в клетке и ее гибели. В присутствии аминогликозидов, напротив, наблюдался бактериостатический эффект – в клетках сохранялся высокий остаточный уровень ATPin и Lucin даже при высоких концентрациях антибиотика – часть клеток сохранила жизнеспособность, которые при подходящих условиях могут вернуть способность к делению, что подтверждено данными микробиологического теста. Кроме того, данная тест-система позволяет выявлять отличия среди антибиотиков одной группы по скорости ингибирования рибосом и эффективности их действия, что было продемонстрировано на примере соединений гентамицин, неомицин и канамицин.Высокая чувствительность биолюминесцентной системы, удобство регистрации сигнала и экспрессность анализа дает возможность конструирования биосенсоров или микрофлюидных устройств на основе живых клеток. Разработанный подход удобен для проведения быстрого скрининга лекарственных средств, оценки эффективности их действия и определения МИК.
