ИСТИНА

В фоторецепторных клетках сетчатки млекопитающих зрительный рецептор родопсин при поглощении кванта света инициирует сложный сигнальный каскад, приводящий к снижению концентрации вторичного мессенджера цГМФ и изменению мембранного потенциала нейрона. Ключевую роль в этом механизме играет родопсинкиназа или GRK1 (G-protein-coupled receptor kinase-1), которая фосфорилирует световозбужденный родопсин и способствует его десенситизации. До недавнего времени считалось, что родопсин является единственным субстратом родопсинкиназы. Однако, в соответствии с результатами последних исследований на трансгенных животных, предполагается наличие у GRK1 ранее неизвестных нерецепторных субстратов. Таким образом, GRK1 может быть вовлечена в целый ряд сигнальных путей в рамках зрительного каскада. Литературные данные и наши собственные предварительные результаты указывают на то, что с наибольшей вероятностью фосфорилированию под действием GRK1 подвергаются гамма-субъединица фоторецепторной цГМФ-фосфодиэстеразы PDE6 и белок-активатор гуанилатциклазы-2 (GCAP2). В настоящей работе мы задались целью выявить новые субстраты GRK1 с использованием разработанного нами протеомного подхода и охарактеризовать активность фермента в отношении гамма-PDE6 и GCAP2 в реконструированной фоторецепторной системе. Эффективность фосфорилирования будет исследована в присутствии и в отсутствие основного субстрата/активатора GRK1 родопсина и кальций-зависимых регуляторов фермента – рековерина и нейронального кальциевого сенсора-1 (NCS1). Участки фосфорилирования в молекулах гамма-PDE6 и GCAP2 будут определены с использованием мутантных форм этих белков. Изучение альтернативных субстратов GRK1 необходимо для понимания молекулярных механизмов зрения в норме и в патологических условиях, связанными с врожденными мутациями в гене GRK1 и другими нарушениями ее активности.

1) Разработка и оптимизация протеомного подхода для выявления новых нерецепторных субстратов GRK1 в физиологических условиях, а также в условиях in vitro в реконструированной фоторецепторной системе. 2) Идентификация белков, подвергающихся фосфорилированию экзогенной или эндогенной GRK1 в условиях отсутствия/подавления активности других фоторецепторных протеинкиназ, методом масс-спектрометрического анализа. 3) Получение генетической конструкции, содержащей полноразмерную кДНК гамма-субъединицы PDE6. 4) Исследование влияния на эффективность фосфорилирования PDE6 и GCAP2 различных факторов системы, а именно: ионов кальция и магния, основного субстрата/активатора GRK1 родопсина в составе фоторецепторных мембран; рековерина и NCS1; а также высокоспецифичных ингибиторов других фоторецепторных протеинкиназ. 5) Предсказание с помощью биоинформатических инструментов из базы данных OMICtools участков фосфорилирования в структуре гамма-PDE6 и GCAP2. 6) Проектирование и получение мутантных белков с точечными заменами по указанным сайтам, препятствующими включению фосфата. 7) Определение по результатам фосфорилирования мутантных белков в условиях in vitro сайтов фосфорилирования для GRK1 в аминокислотных последовательностях новых субстратов.

Лаборатория зрительной рецепции отдела сигнальных систем клетки НИИФХБ МГУ имеет значительный опыт исследований молекулярных механизмов зрения. Сотрудниками нашей лаборатории был впервые описан фоторецепторный Ca2+-связывающий белок рековерин и экспериментально доказана его роль в регуляции фосфорилирования родопсина под действием GRK1. Открытый нами механизм лег в основу многолетнего исследования фундаментальных принципов функционирования всего зрительного каскада. Так, в рамках этой работы нами были подробно изучены механизм реакции фосфорилирования световозбужденного родопсина и участие рековерина в этом процессе. Впоследствии нами было показано, что рековерин и универсальный кальциевый сенсор кальмодулин осуществляют регуляцию GRK1 совместно. Также нами впервые были получены данные о влиянии рафт-структур фоторецепторных мембран и их интегрального компонента кавеолина-1 на способность рековерина модулировать активность GRK1 и исследовано влияние аутофосфорилирования GRK1 на ее взаимодействие с родопсином. Используя протеомный подход, мы выполнили поиск новых регуляторных мишеней родственного рековерину кальциевого сенсора NCS1 в фоторецепторной клетке, и среди потенциальных сигнальных партнеров этого белка была идентифицирована GRK1. Затем на разработанной нами реконструированной системе было показано, что NCS1 действительно способен высокоспецифично регулировать активность GRK1. Сформированный научный коллектив владеет широким спектром современных экспериментальных и биоинформатических методов и подходов, включая молекулярное клонирование, мутагенез, работу с клеточными культурами и образцами животных тканей, хроматографию, спектрофотометрию, спектроскопию поверхностно-плазмонного резонанса. Коллектив обладает знаниями и навыками, необходимыми для проведения этой работы, что позволяет ожидать ее успешных результатов.