ИСТИНА

У цианобактерий существует механизм регуляции потока энергии возбуждения между антенными комплексами и фотосистемами. В основе регуляции лежит функционирование фотоактивного белка, содержащего каротиноид в качестве кофактора (оранжевый каротиноидный белок, ОСР). Под действием света высокой интенсивности ОСР переходит из оранжевой формы в активную красную, способную взаимодействовать с антенной и эффективно конвертировать энергию электронного возбуждения в тепло, предотвращая образование активных форм кислорода. Поскольку оранжевая форма ОСР не способна взаимодействовать с антенными комплексами цианобактерий в научной литературе данное состояние ОСР отождествляют с не активным.

Cyanobacteria developed a mechanism for regulation of the excitation energy transfer between the antenna complexes and photosystems. The regulation is based on the functioning of a photoactive protein containing a carotenoid as a cofactor (orange carotenoid protein, OCP). Under the influence of high-intensity light, the OCP converts from the orange form into the active red, capable of interacting with the antenna and effectively converting the energy of the electronic excitation into heat, preventing the formation of reactive oxygen species. Since the orange form of the OCP is not capable of interacting with cyanobacterial antenna complexes, this state of OCP is identified as inactive in the scientific literature. However, the latest results of experimental studies (including those obtained by our research group) show that even in the orange form, the OCP is able to quench the excitation energy of organic dyes and green fluorescent protein. This fact indicates that only physical contact with the antenna is necessary for OCP in order to perform its protective functions in vivo, and the energy interaction is principally possible for both the orange and the red form of the OCP. However, the nature of the energetic interactions of OCP with antennas in the excited state, which is the basis of photoprotective mechanisms, has not been studied enough. Within the framework of this project, we will study the properties of chimeric structures based on OCP and a number of fluorescent proteins with different spectral characteristics. This will allow us to estimate the influence of such factors as the distance, spectral overlap, and the orientation of the dipole moments on the efficiency of the excitation energy transfer to the OCP in different states. The results of the study will reveal novel aspects of OCP functioning which is important for understanding the photoprotective mechanisms of cyanobacteria.

Целью проекта является изучение механизмов преобразования энергии лежащих в основе фотозащитных реакций цианобактерий, регулируемых оранжевым каротиноидным белком. Для этого будут использованы конструкции, имитирующие комплекс из антенны – донора энергии, и ОСР – акцептора энергии. Задачами проекта являются: 1. Создание и выделение химерной конструкции - комплекса ОСР и флуоресцентного белка. Описание олигомерного состояния и способности связывать каротиноиды. 2. Создание модели комплекса in silico. Определение расстояний между донором и акцептором энергии, а также ориентации дипольных моментов переходов. 3. Изучение спектрально-временных характеристик комплекса in vitro. Определение эффективности миграции энергии для различных состояний ОСР (оранжевая и красная формы) и типов флуоресцентных белков (зеленый, красный, ИК и т.д.) 4. Изучение фотоциклических переходов в химерных конструкциях по флуоресценции флуоресцентных белков, сопоставление с данными абсорбционной спектроскопии (изменения поглощения каротиноида). 5. Сопоставление экспериментальных данных и моделирования, определение путей переноса и диссипации энергии в гибридных структурах и участия различных электронных уровней каротиноида в этих процессах.

Нами было впервые показано, что в качестве индикатора структурных изменений OCP можно использовать его собственную (триптофановую) флуоресценцию, чувствительную к изменениям, связанным с фотоактивацией. Аналогичный подход применялся ранее для исследования изменения конформации другого фотосенсорного белка – PYP (photoactive yellow protein), для которого был показан перенос энергии с триптофанового остатка на хромофор, а также показана “неупорядоченность” структуры сигнального состояния. В наших экспериментах было показано, что интенсивность собственной флуоресценции OCP растет при его фотоактивации, а характерное время снижения интенсивности свечения после выключения синего света близко ко времени перехода ОСР из активной красной формы в оранжевую, определенному по изменению спектральных характеристик (спектра поглощения) хромофора. Таким образом, установлено, что динамика структурных и спектральных изменений OCP при его фотоактивации совпадает, что подтверждает определяющую роль белковой матрицы в формировании красной формы хромофора. Также нами впервые было установлено, что ОСР способен образовывать комплексы с гидрофобными красителями и, на примере Нильского Красного показано, что переход из оранжевой формы в красную сопровождается увеличением доступности для растворителя центральной впадины между N и С-доменами ОСР, что говорит о значительных изменениях третичной структуры белка. С помощью комбинации рамановской спектроскопии и методов молекулярного моделирования мы установили, что одним из первых конформационных изменений хромофора ОСР может являться поворот кольцевой группы в С-домене, сопровождающийся разрывом водородных связей. Вышеперечисленные результаты легли в основу статьи, опубликованой в 2015 году в престижном журнале Biophysical Journal (Maksimov, E. G., et al. (2015). "The Signaling State of Orange Carotenoid Protein." Biophys J 109(3): 595-607).

Существующие представления о механизмах диссипации энергия возбуждения антенных комплексов цианобактерий не укладываются в рамках одной (рабочей) модели. До недавнего времени считалось что оранжевая форма ОСР не способна вызывать тушение флуоресценции антенн, однако, как оказалось это обусловлено в первую очередь отсутствием белок-белковых взаимодействий, и как следствие большим расстоянием между донором и акцептором энергии. Природа же энергетического взаимодействия также остается предметом научных дискуссий, так, например, подчеркивается, что диполь-дипольное взаимодействие через уровень S2 каротиноида малоэффективно из-за малой величины перекрывания спектров флуоресценции донора и поглощения энергии, и, следовательно, низкой скорости переноса. В тоже время диполь-дипольные взаимодействия через уровень S1 вообще невозможны из-за симметрии молекулы каротиноида и отсутствия дипольного момента перехода, а перенос электрона по механизму Декстера маловероятен из-за относительно больших расстояний между донором и акцептором. Миграция энергии по экситонному механизму не может объяснить результаты наших экспериментов, в которых мы наблюдали высокоэффективное тушение флуоресценции хромофоров энергия кванта которых не совпадает с энергией перехода S0-S1 в каротиноидах. Для установления механизма захвата энергии возбуждения молекулой каротиноида необходим подход, позволяющий контролировать многие параметры, влияющие на эффективность энергетических взаимодействий. Это возможно, когда хорошо известны свойства и спектральные характеристики донора энергии, а расстояние между донором и акцептором является фиксированным. Таким образом создание химерных конструкций из ОСР и флуоресцентных белков может решить сразу несколько проблем, связанных с неопределенностью строения нативных антенных комплексов цианобактерий и комплекса с ОСР. Результаты исследования позволят выявить аспекты функционирования ОСР, важные для понимания фотозащитных механизмов цианобактерий.