ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИСТИНА ПсковГУ |
||
Индуцируемая гипоксией или ишемией гибель клеток, в том числе при инсульте, является одной из главных причин смертности людей (около 30%) или их инвалидности. В Российской Федерации около 600 тысяч людей ежегодно страдают от ишемического повреждения мозга. Для того, чтобы снизить этот показатель необходимо с одной стороны понять механизмы индуцируемой гипоксией/ишемией гибели клеток, а с другой – выявить эндогенные защитные механизмы, предотвращающие эту гибель, которые принято относить к сигнализации ишемической или гипоксической толерантности. В отношении головного мозга в последнее время становится очевидно, что как механизмы повреждения, так и механизмы адаптации тем или иным способом, регулируются совокупностью нескольких типов клеток мозга. Это, прежде всего нейроны, астроглия, микроглия, эндотелий кровеносных сосудов и некоторые другие. Вместе эти клетки образуют функциональную единицу называемую нейроваскулярным ансамблем (neurovascular unit). Именно взаимодействие клеток нейроваскулярного ансамбля определяет возможности адаптации мозга к повреждающим воздействиям и гибель или выживание нейронов в условиях стресса, например при ишемии. Таким образом, полноценное рассмотрение механизмов взаимодействия различных типов клеток мозга, а также возможность дистантного взаимодействия клеток мозга с другими клетками организма через удаленную сигнализацию (нервную или гуморальную) является основным подходом к развитию стратегий защиты мозга от негативных последствий инсульта и других патологических состояний. Конкретная задача состоит в изучении межклеточных взаимодействий, сигнальных, гуморальных, электрических, лежащих в основе функционирования нейроваскулярного блока в условиях стресса и в условиях адаптации. Необходимо понять механизмы сигнализации и ее регуляцию между нейронами и астроглией, нейронами и микроглией и т.д. при развитии ишемического повреждения. Нужно также определить взаимодействия между клетками головного мозга и клетками, приходящими в мозг извне, такими как иммунные клетки или стволовые клетки. Наконец не следует забывать о возможности воздействия на нейроваскулярный блок сигналами из других органов и тканей, которые могут нести информацию о перенесенной этими органами ишемии и таким образом подготавливать, адаптировать нервную ткань к перенесению стресса. Для изучения нейродегенеративных и нейропротекторных механизмов мы планируем использовать модель фокальной ишемии головного мозга, вызванной перекрытием средней мозговой артерии нитью, которая является наиболее признанной в мире моделью инсульта. В качестве защитных адаптивных воздействий будут рассмотрены удаленное ишемическое прекондиционирование мышц и локальное прекондиционирование мозга. И если первый подход достаточно широко исследуется на моделях других патологий, то второй требует новаторских решений и возможно будет реализован впервые в мире. Данные подходы позволят выявить вероятную универсальность или различия в механизмах реализации нейропротекторных сигналов при инсульте и роль в этих процессах различных типов клеток нейроваскулярного ансамбля. Также надо принимать во внимание, что определение участников патологических и адаптивных сигнальных каскадов позволит разработать новые фармакологические препараты и выявить мишени для анти-инсультных подходов. Другим подходом к изучению межклеточных взаимодействий при инсульте и адаптации к нему станут методики совместных культур различных компонентов нейроваскулярного ансамбля. В этом плане наш коллектив по многим направлениям является пионером. Еще одним аспектом исследования является поиск гуморальных факторов передачи нейропротекторного сигнала от ишемизированного органа и дальнейшее детальное изучение внутриклеточных событий, проводящих к выработке устойчивости головного мозга к ишемии. Используемые подходы и ожидаемые результаты сопоставимы с мировым уровнем, причем ряд исследований будет проводиться впервые.
В ходе работы было проведено исследование представленности отдельных типов клеток в мозге крысы в ходе онтогенеза и после ишемии. Разные сроки возникновения и пролиферации клеток определяют цитоархитектонику мозга на определённой стадии его развития. Раньше всего дифференцируются нейроны; массовая дифференцировка астроцитов и экспрессия ими маркёра GFAP наблюдается на момент рождения. Патологические состояния, например, ишемия, нарушают нормальное соотношение клеточных элементов, вызывая массовую гибель всех типов клеток в очаге поражения, нарушение целостности гемато-энцефалического барьера и активацию воспалительных процессов. Исследования индивидуальной чувствительности клеток к ишемии показали, что наибольшая гибель в условиях кислородно-глюкозной депривации наблюдается среди нейронов, но ишемия негативно влияет на все исследованные клетки, являющиеся компонентами НВЕ. Прединкубирование клеток в среде с различными концентрациями хлорида лития и вальпроата натрия в большинстве случаев способствовало повышению жизнеспособности клеток в использованных условиях, но эффект был неодинаков для конкретных клеточных культур и, как правило, зависел от концентрации действующего агента. Опыты по сокультивированию компонентов НВЕ показали, что между разными типами клеток не только существуют контакты, но и возможен прямой обмен компонентами цитоплазмы. Таким образом, мы полагаем, что разработка нейропротекторной терапии должна основываться на комплексном воздействии на НВЕ в целом, так как, функционируя как единая система, она обладает рядом эмерджентных свойств, не сводимых к сумме свойств отдельных её компонентов. Знание особенностей межклеточных взаимодействий внутри НВЕ открывает новые возможности в поиске новых методов лечения многих нейродегенеративных заболеваний, а также разработке эффективных методов защиты тканей мозга при различных патологических состояниях.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 14 апреля 2015 г.-31 декабря 2015 г. | Изучение механизмов адаптации мозга к повреждающим стимулам через межклеточную и межорганную сигнализацию |
Результаты этапа: В ходе выполнения данного проекта в 2015 году были подобраны условия для выделения и культивирования чистых культур нейронов и астроглии. Каждая культура была охарактеризована по набору фенотипических маркеров, а также была подсчитана доля тех или иных клеток в каждой культуре. Таким образом, нами отработаны условия получения и культивирования первичных культур нейронов и астроглии, минимально перекрестно загрязненные нецелевыми типами клеток, то есть в нейрональной культуре отсутствует глия, а в астроглиальной культуре отсутствуют микроглия и предшественники олигодендроцитов. Также были подобраны условия для создания модельной ишемии (кислородно-глюкозной депривации) на каждом типе клеток, образующих нейроваскулярную единицу (нейроны, астроглия и эндотелиоциты), так были определены длительность ишемии и реоксигенации, приводящие к оптимальной для дальнейших экспериментов гибели клеток. Было проанализировано влияние модельных цитопротекторов с доказанной нейропротекторной активностью, хлорида лития и вальпроата натрия, на гибель основных компонентов нейроваскулярной единицы при моделировании ишемии in vitro. Показано, что и хлорид лития и вальпроат натрия эффективно предотвращали гибель нейронов, астроцитов и клеток эндотелия при кислородно-глюкозной депривации. Оценка гибели различных типов клеток нейроваскулярной единицы является важной составляющей фундаментальных исследований механизмов повреждения головного мозга и доклинических исследований потенциальных нейропротекторных препаратов. В этой связи мы провели сравнительное исследование двух наиболее часто применяемых методов: иммуногистохимического окрашивания срезов мозга, позволяющего определять количество и локализацию определенных клеток в ткани среди других типов клеток, и иммуноблоттинга, выявляющего специфические белки в общем гомогенате ткани. Мы обнаружили, что в зависимости от типа клеток изменения их числа и состава после инсульта могут быть диффузными или локализованными, что накладывает ограничения на применение того или иного метода оценки их количества в ткани мозга. В целом, наиболее предпочтительным представляется использование иммуногистохимии, однако, с определенными ограничениями при оценке количества астроглии и микроглии может применятся иммуноблоттинг. Используя магнитно-резонансную томографию было проанализировано состояние сосудистого эндотелия головного мозга после ишемии/реперфузии, произведена функциональная оценка состояния гемато-энцефалического барьера у животных in vivo. Были отработаны условия адаптации головного мозга к ишемии с помощью воздействия на ткань удаленных от мозга органов (скелетных мышц). Проанализированы продолжительность периода ишемизации мышцы, длительность периода между ишемией мышцы и ишемией головного мозга, количество циклов ишемии/реперфузии мышц, дающих оптимальную защиту головного мозга от инсульта. Подобраны типы наркоза, выработаны методики перекрытия сосудов головного мозга, отработаны оптимальные режимы. Было показано, что удаленное ишемическое прекондиционирование задних конечностей крысы выполненное непосредственно перед индукцией ишемии головного мозга оказывало слабое восстановление неврологического статуса, тогда как прекондиционирование выполненное за 24 ч до индукции ишемии головного мозга, вызывало ярко выраженное нейропротекторное действие. | ||
2 | 11 января 2016 г.-23 декабря 2016 г. | Изучение механизмов адаптации мозга к повреждающим стимулам через межклеточную и межорганную сигнализацию |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".