ИСТИНА

Собрана коллекция из 52 изолятов Colletotrichum coccodes, выделенных из пораженных клубней, листьев и стеблей картофеля в разных регионах России. Все штаммы C. coccodes охарактеризованы по последовательностям нуклеотидов ядерных рибосомных генов и межгенных спейсеров (ITS), генов глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы, актина и глутамин-синтетазы, а также по морфолого-культуральным признакам: исследованы размеры склероциев, длина и ширина спор, длина щетинок. Исследованные морфологические и генетические параметры находились в пределах допустимых для вида C. coccodes; сильно отличающихся штаммов не было выявлено. С помощью клонирования в E. coli и последующего секвенирования по Сэнгеру бактериальных клонов без выделения чистых культур исследована микобиота пораженных листьев паслена сладко-горького (Solanum dulcamara L.), и здоровых листьев картофеля сортов Жуковский ранний и Сирень. На листьях паслена сладко-горького выявлены 14 видов грибов, в т.ч. Colletotrichum acutatum J.H. Simmonds и C. gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc. С листьев картофеля выявлено 11 видов. Большинство выявленных видов как с паслена, так и с картофеля, были типичными патогенами пасленовых. Проведена оценка фунгицидной и бактерицидной активности культуральной жидкости и растущих изолятов гриба на жидких и твердых питательных средах. Наибольшая фитотоксическая активность была отмечена на среде Чапека с витаминами. Полученные экстракты были существенно более активны в отношении пырея ползучего, чем томата. Антибиотической активности не было отмечено.

A collection of 52 isolates of Colletotrichum coccodes isolated from diseased tubers, leaves and stems of potatoes in different regions of Russia. All strains of C. coccodes were characterized on the nucleotide sequences of the nuclear ribosomal genes and the internal spacers (ITS), genes glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, actin and glutamine synthetase, as well as in morphological and cultural characteristics: the size of the sclerotia, the length and width of spores, length of bristles. Investigated morphological and genetic parameters were within the allowable for the species C. coccodes; very different strains were not identified. Using of cloning in E. coli and sequencing of bacterial clones without isolation of pure cultures mycobiota of the affected leaf nightshade sweet-bitter (Solanum dulcamara L.), and healthy leaves of potato cultivars Zhukovskii early and Siren were investigated. On the leaves of S. dulcamara 14 species of fungi, including Colletotrichum acutatum J. H. Simmonds and C. gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc were identified. From the leaves of potatoes identified 11 species. Most identified fungy were typical solanaceous pathogens. Evaluation of fungicidal and bactericidal activity of culture liquid and the growing isolates of the fungus on liquid and solid nutrient media was done. The highest phytotoxic activity was observed in the environment of čapek with vitamins. The obtained extracts were significantly more active against quack grass than tomato. Antibiotic activity was not noted.

1. Проведен сбор пораженных образцов клубней, стеблей, листьев и плодов в ранее не охваченных регионах. 2. Изучен видовой состав вновь собранных изолятов по культурально-морфологическим и молекулярно-генетическим (секвенирование по Сэнгеру и видоспецифичные ПЦР-праймеры) признакам. Проведена оценка устойчивости изолятов к фунгицидным препаратам. 3. Проведено изучение видового состава пораженных органов с симптомами черной пятнистости или антракноза с помощью клонирования в E. coli и последующего секвенирования клонов без выделения чистых культур. Проведен анализ ДНК пораженного органа с помощью мультикопийного секвенирования. Проведена биоинформационная обработка результатов. 4. Проведена идентификация видов рода Colletotrichum в пораженных органах растений и в почве с помощью видоспецифичных тест-систем для ПЦР без выделения чистых культур. 5. Проведена оценка фунгицидной и бактерицидной активности культуральной жидкости и растущих изолятов C. coccodes на разных типах сред.

Собрана коллекция из 52 изолятов Colletotrichum coccodes, выделенных из пораженных клубней, листьев и стеблей картофеля в разных регионах России. Проведено изучение устойчивости коллекционных изолятов к фунгицидам пенцикурон (препарат Престиж), флудиоксонил (Максим), дифеноконазол (Скор), азоксистробин (Квадрис), тиабендазол (Вист, Текто), коллоидное серебро (Зерокс). Исследования показали, что эффективным фунгицидным действием обладали дифеноконазол (усредненный по всем исследованным изолятам показатель ЕС50 = 0,06 при вариабельности 0,05-0,12) и коллоидное серебро (средний ЕС50=5,0, вариабельность 1,2 - 7,0). Хорошим фунгистатическим действием обладали азоксистробин (средний ЕС50=2,1, вариабельность 0,05- 19), флудиоксонил (средний ЕС50=0,7, вариабельность 0,58 - 0,88), тиабендазол (средний ЕС50=8,5, вариабельность 0,9 - 50,3). Пенцикурон (средний ЕС50 >100, вариабельность - все изоляты >100) показал крайне низкую эффективность. Флудиоксонил эффективно останавливал радиальный прирост колонии, но изоляты не погибали. Через 3-4 недели инкубирования с флудиоксонилом у тестируемых колоний появлялись устойчивые к фунгициду сектора. После пересадки кусочков мицелия из устойчивых секторов на чашку Петри со средой, содержащей флудиоксонил, рост колонии на среде с фунгицидом не отличался от роста на среде с бесфунгицидным контролем (средний ЕС50 >100), т.е. изоляты приобретали устойчивость.

1. Продолжение пополнения коллекции изолятов Colletotrichum sp. Сбор пораженных образцов клубней, стеблей, листьев и плодов в ранее не охваченных регионах. В 2016 году были выделены в чистые культуры 7 изолятов Colletotrichum coccodes из стеблей картофеля и 4 изолята из листьев картофеля. В нашей работе такое выделение удалось провести впервые; в листьях Colletotrichum coccodes встречается редко, в мировых коллекциях представлены только штаммы, выделенные из клубней или из почвы. Также были выделены 8 изолятов из клубней картофеля, собранных на разных полях Московской области. 2. Анализ вновь собранных и коллекционных изолятов. Изучение видового состава по культурально-морфологическим и молекулярно-генетическим признакам, а также устойчивости к фунгицидным препаратам. Протестированы 52 штамма, выделенные из пораженных образцов, собранных в Костромской, Владимирской, Московской областях, Республике Марий Эл, а также из импортированных в Россию из Германии и Голландии клубней семенного картофеля. Все штаммы C. coccodes охарактеризованы по последовательностям нуклеотидов ядерных рибосомных генов и межгенных спейсеров (ITS), генов глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы, актина и глутамин-синтетазы, а также по морфолого-культуральным признакам. Анализ последовательностей нуклеотидов ITS выявил разделение выборки на 2 группы, различающиеся одним нуклеотидом. В первой группе, представленной 4 разными изолятами, отмечены только изоляты, выделенные из импортированного из Германии семенного картофеля. Во второй группе были как российские штаммы, так и выделенные из голландского и германского семенного картофеля. Последовательности гена GAPDH разделились на 2 большие группы, различающиеся по 2 нуклеотидам. В обе группы попали как российские, так и европейские изоляты. Последовательности ДНК гена актина были одинаковыми практически для всех исследуемых изолятов и совпадали с имеющимися в базе Genbank сиквенсами типовых изолятов. Единственный изолят, отличающийся 2 нуклеотидами, был выделен из стебля картофеля в Московской области. Последовательности гена глутамин-синтетазы разделились на 2 большие группы, различающиеся по 1 нуклеотиду. В обе группы попали как российские, так и европейские изоляты. Коллекционные изоляты охарактеризованы по культурально-морфологическим признакам, исследованы размеры склероциев, длина и ширина спор, длина щетинок. Исследованные морфологические параметры находились в пределах допустимых для вида C. coccodes; сильно отличающихся штаммов не было выявлено. 3. Изучение видового состава пораженных органов с симптомами черной пятнистости или антракноза с помощью клонирования в E. coli и последующего секвенирования по Сэнгеру бактериальных клонов без выделения чистых культур. Исследована микобиота пораженных листьев паслена сладко-горького (Solanum dulcamara L.), и здоровых листьев картофеля сортов Жуковский ранний и Сирень, растущих на территории МГУ имени М.В. Ломоносова недалеко от центра Москвы. Сразу после сбора листья замораживали при –75ºС для последующего выделения ДНК, листья S. dulcamara также закладывали во влажные камеры для выделения чистых культур. Видовую принадлежность определяли с помощью клонирования в E. coli и последующего секвенирования видоспецифичных фрагментов ДНК, в качестве которых использовали участок рибосомной ДНК грибов, включая регионы ITS1 и ITS2. Амплификацию из тотальной ДНК пораженного листа проводили с помощью праймеров ITS1f и ITS4. Для более полного выявления видового состава грибов из пораженных листьев паслена выделяли чистые культуры грибов. Исследования 4 образцов пораженных листьев S. dulcamara с помощью клонирования и 16 образцов методом выделения чистых культур выявили присутствие 14 видов грибов: Alternaria alternata (Fr.) Keissl, Aureobasidium pullulans (de Bary) G. Arnaud, Boeremia exigua (Desm.) Aveskamp, Gruyter & Verkley (=Phoma exigua Desm.), Botrytis cinerea Pers., Cladosporium cladosporioides (Fresen.) G.A. de Vries, Cladosporium herbarum (Pers.) Link, Cladosporium tenuissimum Cooke, Colletotrichum acutatum J.H. Simmonds, Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., Coniothyrium fuckelii Sacc., Fusarium oxysporum Schltdl., Phoma herbarum Westend., Phytophthora infestans (Mont.) de Bary, Thanatephorus cucumeris (A.B. Frank) Donk., Thielavia basicola Zopf. Видовую принадлежность 4 образцов установить не удалось: Cryptococcus sp., Mycosphaerella sp., Phialophora sp., Phoma sp. Исследования 2 образцов листьев картофеля сортов Сирень и Жуковский ранний без симптомов поражения с помощью клонирования и последующего секвенирования выявили присутствие 11 видов грибов: Alternaria alternata (Fr.) Keissl, Aureobasidium pullulans (de Bary) G. Arnaud, Cladosporium cladosporioides (Fresen.) G.A. de Vries, Cladosporium herbarum (Pers.) Link, Cryptococcus wieringae Á. Fonseca, Scorzetti & Fell, Hymenoscyphus scutula (Pers.) W. Phillips, Mycocentrospora acerina (R. Hartig) Deighton, Phaeohelotium epiphyllum (Pers.) Hengstm., Phaeosphaeria culmorum (Auersw.) Leuchtm, Plectosphaerella cucumerina (Lindf.) W. Gams, Zalerion arboricola Buczacki. Большинство выявленных видов как с паслена, так и с картофеля, были типичными патогенами пасленовых. Найдены виды, способные вызвать аллергии и микозы у людей со сниженным иммунитетом, а также потенциальные производители токсинов. Во всех исследованных образцах одновременно присутствовали от 5 до 8 видов грибов. 4. Идентификация видов рода Colletotrichum в пораженных органах растений и в почве с помощью видоспецифичных тест-систем для ПЦР без выделения чистых культур. С помощью тест-системы (Cullen et al., 2002) для идентификации вида Colletotrichum coccodes исследовано 188 фиксированных пораженных образцов листьев картофеля и томата из областей Европейской части России. Картофель (всего исследовано 96 образцов): Новгородская обл. (9 образцов), Карелия (11), Вологодская обл. (12), Костромская обл. (15), Московская обл. (27), Марий Эл (12), Северная Осетия (10). Томат (всего исследовано 92 образца): Тамбовская обл. (17), Костромская обл. (4), Ростовская обл.(26), Ставропольский край (33). Присутствие C. coccodes было выявлено в 4-х образцах листьев картофеля: 1 из Костромской области, 2 - из Марий Эл, и 1 из Северной Осетии; и в 13 образцах листьев томата: 8 из Ростовской области и 5 - из Ставропольского края. 5. Оценка фунгицидной и бактерицидной активности культуральной жидкости и растущих изолятов. Были исследованы экстракты гриба при его росте на жидких и твердых питательных средах. Штаммы культивировали на четырёх агаризованных средах: картофельно-глюкозный агар (КГА), мальтозный агар (МА), овсяный агар (ОА), агаризованная среда Чапека с витаминами (ЧАВ), двух зерновых субстратах: пшённая и перловая крупа, и на жидкой среде, содержащей дрожжевой и мальтозный экстракты (ДМГ). Наибольшая фитотоксическая активность экстрактов культуры 4-х штаммов С.coccodes в отношении 2-х видов тест-растений была отмечена на среде ЧАВ. При этом полученные экстракты были существенно более активны в отношении пырея ползучего, чем томата. Антибиотической активности в отношении испытанных тестовых микроорганизмов ни для одного из исследуемых экстрактов культуры 4-х штаммов C. coccodes на различных питательных субстратах не было отмечено.