ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИСТИНА ПсковГУ |
||
Вирус гриппа типа А относится к группе оболочечных вирусов Orthomyxoviridae с сегментарным однонитевым негативным РНК-геномом, кодирующим по последним данным 17 (18) белков. Инфекционный процесс обеспечивается множественными согласованными взаимодействиями этих белков между собой и с клеточными компонентами при заражении клетки, синтезе вирусных РНК/белков, морфогенезе дочерних вирионов. Направленное нарушение этих взаимодействий можно было бы использовать для изменения фенотипа вируса при конструировании живых гриппозных вакцин. При этом важно знать конкретные аминокислотные остатки, обеспечивающие взаимосвязь белков в составе функционально важных комплексов, возникающих на разных стадиях жизненного цикла вируса. В данном проекте мы планируем использовать возможности биоинформатики для поиска пар ко-эволюционирующих аминокислотных остатков у функциональных белков-партнеров. Подход базируется на гипотезе, что в силу пространственных ограничений в зоне контакта пары аминокислотных остатков эволюционируют согласованно. Высокая изменчивость вируса гриппа и наличие больших выборок аминокислотных последовательностей в базе данных создают хорошие предпосылки для применения такого подхода. Ввиду предшествующего задела, мы предполагаем в первую очередь сконцентрироваться на белках оболочки вириона, обеспечивающих сборку и почкование полноценных вирусных частиц, в частности, на паре матриксный белок М1 - мембранный белок М2. Кроме того, мы планируем изучить функциональные взаимосвязи неструктурного белка NS1, являющегося основным фактором вирулентности вируса (антагонистом интерферона). Нарушение образования комплексов этого белка с другими вирусными белками в инфицированной клетке должно привести к аттенуации вируса. Предсказания будут проверены экспериментально. С использованием ПЦР-мутагенеза планируется введение аминокислотных замен, нарушающих взаимодействие белков и, как следствие, снижающих репродукцию и вирулентность вируса, в один из белков-партнеров, и последующее введение второй (компенсаторной) мутации во второй белок-партнер с целью восстановления белковых взаимодействий/ инфекционной активности вируса. Техника обратной генетики будет использована для получения рекомбинантных вирусных частиц, содержащих мутантные белки. Нарушение/ восстановление ассоциации белков предполагается оценивать с помощью биохимических, масс-спектрометрических, молекулярно-биологических и иммунохимических тестов, формирование вирионов - методами электронной микроскопии, а репродуктивную активность и вирулентность вируса рядом стандартных и современных вирусологических методик.
Результаты работы представлены на регулярной (проводимой 1 раз в три года) международной конференции по негативно-нитевым вирусам (NSV-2015) и отражены в статьях в журналах Наноиндустрия (2015), Viruses (2015), Virus Research (2017), а также представлены на научных вирусологических и протеомных симпозиумах в 2016 и 2017 гг.
НИИ ВС им. И.И. Мечникова | Соисполнитель |
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 2 февраля 2015 г.-31 декабря 2015 г. | Поиск молекулярных детерминант взаимодействия белков при патогенезе вируса гриппа |
Результаты этапа: | ||
2 | 14 марта 2016 г.-31 декабря 2016 г. | Поиск молекулярных детерминант взаимодействия белков при патогенезе вируса гриппа |
Результаты этапа: Продолжен анализ морфологии вирионов методом трансмиссионной электронной микроскопии (негативный контраст) с целью выявления аминокислотных остатков, изменяющих сферический фенотип на филаментозный, с привлечением новейших протоколов подготовки препаратов вируса для анализа. Обнаружено, что в препаратах рекомбинантных вирионов, содержащих как исходный ген белка М1, так и ген с введенными мутациями (V219I; C126S), присутствует значительное количество (до 30%) удлиненных и филаментозных частиц, в отличие от препаратов лабораторно культивируемого штамма A/WSN/33 (H1N1) (более 95% сферических частиц). Продолжена оптимизация биоинформатического поиска пар скоррелированных аминокислотных позиций у взаимодействующих белков одного генома на примере белков М1 и NS1 вируса гриппа. Подтверждены ранее найденные и выявлено несколько новых интересных пар остатков в парах белков M1-M2, NS1-NP, NS1-М1. | ||
3 | 20 марта 2017 г.-31 декабря 2017 г. | Поиск молекулярных детерминант взаимодействия белков при патогенезе вируса гриппа |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".