ИСТИНА

Фундаментальной задачей, на решение которой направлен проект, является изучение структуры гликопротеинов, молекулы которых ассоциированы с липидами и не связаны ковалентно с основными структурными полимерами КС дрожжей (здесь и далее NCBGLA от англ. non-covalently bound glycoprotein, lipid-associated), обнаруженных нами на клеточной поверхности Saccharomyces cerevisiae и получение ответа на вопрос какова роль этих соединений в регуляции метаболической активности клеточной стенки дрожжей. Основным полученным в процессе выполнения первого этапа работы по проекту результатом является разработка схемы выделения и получение в препаративном количестве выявленного нами ранее NCBGLA-12. Во фракциях, получаемых из клеточных стенок дрожжей S. cerevisiae с использованием детергентов и бутанола, обнаружены соединения, предварительная характеристика которых позволяет отнести их к группе NCBGLA. Получены антитела к NCBGLA-12 и проверена их специфичность. Оценено содержание NCBGLA-12 в клеточных стенках так называемого дикого типа дрожжей S.cerevisiae “а-” и “альфа”-типов спаривания. Показано, что содержание этого соединения в клеточных стенках клеток “а-” и “альфа”-типов спаривания различается на разных стадиях роста культуры дрожжей. С использованием полученного препарата начата проверка высказанного нами предположения о том, что NCBGLA-12 может являться регулятором метаболической активности клеточной стенки дрожжей, а именно: начато изучение влияния данного соединения на активность и способность к фибриллообразованию глюкантрансферазы Bgl2p, Анализ полученных результатов в совокупности с данными, опубликованными недавно в литературе (Vargas et al., 2014), позволяют сделать предположение о том, что изучаемые в данном проекте NCBGLA принадлежат к транзитным соединениям КС и являются частью содержимого транс-КС везикул, окружённых липидной мембраной, которые могут присутствовать в среде культивирования дрожжей и о наличии которых в клеточной стенке высказывались предположения (Алексеева с соавт., 2014; Vargas et al., 2014).Эксперименты, проведенные на втором этапе, были выполнены в соответствии с планом работ заявленным ранее, однако объем полученных результатов превышал запланированный. Весьма продуктивным направлением исследований явилось обнаружение новых липид-ассоциированных соединений – потенциальных регуляторов метаболической активности клеточной стенки. Наиболее значимым результатом работы явилось обнаружение среди соединений, входящих в состав липид-ассоциированной фракции клеточной стенки белков, ранее считавшихся внутриклеточными и мембранными белками, а недавно выявленными за пределами клетки в составе транспортных везикул, экспортирующих метаболически активные соединения из клетки через клеточную стенку дрожжей Candida albicans во внешнюю среду /Vargas et al., 2014/. В частности были обнаружены такие важные для метаболической активности и клеточной стенки дрожжей белки как белок теплового шока Hsp12, глюкантрансфераза Bgl2p и некоторые другие. Изучено взаимодействие глюкантрансферазы Bgl2p и NCBGLA-12, являющихся компонентами фракции NCBGLA . Продемонстрировано ингибирующее влияние NCBGLA-12 на гидролазную активность Bgl2p. Показано, что NCBGLA-12 представляет собой полипептид, гликозилированный по нескольким сайтам. С помощью флуоресцентной микроскопии, метода LC-MS/MS , а также методов электрофореза в ПААГ и Вестерн-блоттинга показано, что Bgl2p является одним из основных белков липид-экстрагируемой фракции КС, при этом будучи экстрагируемым из КС с помощью метода Фолча (экстракция смесью хлороформ-метанол в соотношении 2:1) в данных условиях он в малой степени переходит в раствор, формируя осадок в виде агрегатов, предположительно фибриллярной структуры. Полученные результаты, подтверждающие высказанную гипотезу о важной роли глюкантансферазы Bgl2p в закреплении комплекса NCBGLA в клеточной стенке, позволяют с высокой долей вероятности предполагать наличие в КС белковых микрокомпартментов, содержащих наборы белков, значимых для регуляции метаболической активности КС, закрепление которых в КС происходит с участием Bgl2p. Показано, что в отсутствии Bgl2p в клеточных стенках (получены из клеток, несущих делецию гена, кодирующего белок Bgl2p) не закрепляются прочно такие белки как маннопротеины CWP1 и CIS3, гликопротеины YGP1 и Tos1, инвертаза Inv2, глюкангидролазы Scw4 и Scw10, глюкантрансферазы Gas1 и Gas3, щелочная фосфатаза PPA. Под прочным закреплением в данном случае мы подразумеваем устойчивость данных белков к обработке 1% додецилсульфотом натрия (ДСН) при 37°С в течение часа. В данных условиях Bgl2p и перечисленные белки остаются в составе КС. Результаты, полученные при выполнении работы позволяют составить принципиально новое представление об организации молекулярной структуры КС и роли липидного компонента в целом и компонентов NCBGLA в регуляции метаболической активности клеточной стенки дрожжей.