ИСТИНА

Проект направлен на решение фундаментальной научной проблемы, целью которого является создание и исследование нового класса гибридных биоорганических соединений – протеиназ и их ингибиторов, иммобилизованных на детонационном наноалмазе. Предполагается разработка методов синтеза новых гибридных биоорганических соединений – протеиназ и их ингибиторов, иммобилизованных на детонационном наноалмазе, исследование их свойств, важных с научной и практической точек зрения, пригодных для биомедицинских приложений. Планируется исследование возможности применения полученных веществ в качестве новых перспективных противоопухолевых и антикоагуляционных лекарственных средств, оценка их фармакологической активности и токсического действия in vitro и in vivo.

The project is aimed at solving fundamental scientific problems, the purpose of which is to create and study a new class of hybrid bio-organic compounds - proteases and their inhibitors immobilized on detonation nanodiamonds. The development of methods of synthesis of new hybrid bio-organic compounds - proteases and their inhibitors immobilized on detonation nanodiamonds, the study of their properties , which are important from a scientific and practical point of view will be carried out. It is planned to study the possibility of using the substances obtained as a promising new anticancer and anticoagulant drugs, evaluation of their pharmacological activity and the toxic effect in vitro and in vivo.

Разработать методики иммобилизации на детонационном наноалмазе протеиназ различных классов: трипсина, химотрипсина, папаина, пепсина, субтилизина, термолизина. Проклонировать, экспрессировать в дрожжах Pichia pastoris и разработать метод очистки рекомбинантного ингибитора из гепатопанкреаса камчатского краба, обладающего противоопухолевым и антикоагулляционным действием. Разработать методику иммобилизации на детонационном наноалмазе белковых ингибиторов протеиназ: ингибитора камчатского краба и соевого ингибитора трипсина. Изучить физико-химические свойства полученных гибридных биоорганических соединений методами ПЭМ, ИКС, РФЭС, элементного анализа, аминокислотного анализа и др. Изучить ферментативные свойства полученных гибридных биоорганических соединений на основе протеиназ в сравнении с нативными белками (pH-оптимум, pH-стабильность, температурный оптимум, температурная стабильность, многократность использования, стабильность в присутствии органических растворителей, кинетические константы). Изучить ингибиторные свойства гибридных биоорганических соединений на основе ингибиторов в сравнении с нативными белками (pH-оптимум, pH-стабильность, температурный оптимум, температурная стабильность, стабильность в присутствии органических растворителей, константы ингибирования). Исследовать влияние полученных соединений на раковые клетки при помощи оптической и флуоресцентной микроскопии. Количественно оценить влияние гибридных биоорганических соединений на клетки при помощи пропидиййодида. Выявить белки-мишени действия протеиназ и ингибиторов на раковые клетки. Оценить токсичность наиболее эффективных полученных гибридных протеиназ и их ингибиторов in vitro и in vivo (LD50). Изучить противоопухолевое действие полученных гибридных протеиназ и их ингибиторов на мышиных моделях. Изучить антикоагуляционное действие полученного гибридного ингибитора рекомбинантного ингибитора из гепатопанкреаса камчатского краба на плазме крови.

Имеющийся у коллектива научный задел основан на результатах, полученных ранее в работах, выполненных на Химическом факультете МГУ и в совместных работах Химического факультета МГУ с Рязанским государственным медицинским университетом им. И.П. Павлова (РязГМУ). Группой под руководством Г.Н. Руденской в процессе исследований, поддержанных грантами РФФИ, был выделены и исследованы новые протеолитические ферменты из микроорганизмов, грибов, простейших, насекомых и растений. Последнее время успешно изучались протеиназы гепатопанкреаса камчатского краба, проведена характеристика ряда ферментов камчатского краба, клонированы гены трипсина РС, коллагенолитической протеиназы РС и металлопротеиназы РС, катепсина РС, определены первичные структуры этих ферментов. Полученные данные позволяют обнаружить сходство и различие этих ферментов с аналогами из других источников, найти необычные, полезные свойства, выявить механизм их действия. Также обнаружен ранее неизвестный эндогенный ингибитор коллагенолитических ферментов камчатского краба, обладающий необычными с научной и практической точек зрения свойствами. На основании изучения его свойств он был отнесен к семейству серпинов. Нами было проведено исследование противоопухолевого действия ингибитора на перевиваемой культуре клеток рабдомиосаркомы человека. В качестве контроля исследовали стволовые клетки подкожного жира человека. Оказалось, что ингибитор препятствует образованию монослоя опухолевых клеток. С помощью микроскопии было показано, что при постоянной эффективной концентрации ингибитора в течение нескольких суток оболочка клетки видоизменяется, клетки не растут и не распластываются, по сравнению с контролем. По мере уменьшения концентрации ингибитора, гибель клеток наступает с запозданием, что свидетельствует о дозозависимом эффекте. В контрольных опытах и с культурой стволовых клеток, а также в отсутствие ингибитора токсическое действие на клетки отсутствовало.

За отчетный период были впервые получены конъюгаты наноалмазов (НА) с трипсином, химотрипсином, субтилизином, папаином, ингибитором трипсина из сои, пероксидазы обладающие ферментативной и ингибиторной активностью. Соединения охарактеризованы с помощью аминокислотного анализа и ИК-спектрометрии. Исследованы энзиматические и ингибиторные свойства конъюгатов с химотрипсином, папаином и соевым ингибитором трипсина. С помощью конфокального и электронного микроскопов проведены исследования по взаимодействию полученных конъюгатов с клетками HeLa. НА проникают в клетку путем эндоцитоза и спустя сутки после внесения выявляются во вторичных лизосомах. Эффективность «интернализации» низкая. Конъюгаты протеолитических ферментов с НА оказывают на клетки такое-же действие, как и свободные ферменты. Протеолизу подвергаются белки, экспонированные во внешнюю среду, в том числе – белки адгезии к подложке и, в меньшей степени, белки межклеточных контактов. Изменений во внутренней структуре отдельных органоидов, в строении ядра, эндоплазматического ретикулума и митохондрий в клетках, контактировавших с НА и их конъюгатами с протеолитическими ферментами не выявлено. Предложена модель взаимодействия конъюгатов нано-алмазов и протеолитических ферментов с клетками.