ИСТИНА

Для изучения структуры и функций белков и пептидов в настоящем проекте применяются новейшие протеомные технологии, основанные на масс-спектрометрии. В качестве основы для идентификации и инвентаризации белков и пептидов использованы геномные базы данных объектов модельных организмов, которые служили источниками тканевого и клеточного материала для исследований (сердечная мышца быка Bos taurus и гаметофоры, протонема, протопласты и споры мха Physcomitrella patens). Проведен комплексный анализ белкового состава матрикса и внутренней мембраны митохондрий сердечной мышцы Bos taurus. Разработаны новые подходы для анализа подфракций триптических пептидов, являющихся компонентами экстрамембранных и трансмембранных фрагментов митохондриальных белков. В результате проведен более полный протеомный анализ белков митохондрий сердечной мышцы, в том числе гидрофобных. В рамках настоящего проекта были проведены комплексные исследования по протеомному анализу нового модельного организма с аннотированным геномом - мха Physcomitrella patens с использованием гаметофоров, протонемы и протопластов в качестве источника материала для получения тотальных белковых препаратов. На основе использования пептидной масс-спектрометрии и биоинформатики впервые осуществлен широкомасштабный поиск и идентификация новых пептидов в клетках и тканях растительного объекта. Для тестирования и анализа биологической активности пептидов, идентифицированных в клетках и тканях мха Physcomitrella patens, разработаны модельные системы на основе спор, протопластов, протонемы и гаметофоров. Установлено, что пептиды мха могут проявлять активность на разных этапах развития мхов от прорастания спор до роста гаметофоров.

Проведен комплексный анализ белкового состава матрикса и внутренней мембраны бычьих митохондрий. В работе использован метод разделения белков митохондрий сердечной мышцы Bos taurus на две фракции: «растворимые белки митохондрий» и «белки субмитохондриальных частиц». Идентификацию белкового состава фракции «растворимые белки митохондрий» осуществляли двумя независимыми методами. Для этого использовали классический метод (по общей сумме триптических пептидов фракции) и разработанный нами (по двум подмножествам триптических пептидов: а) содержащих в своем составе остаток/и цистеина; б) не содержащих). Это позволило идентифицировать большее число белков этой фракции и значительно увеличить достоверность их идентификации. Применена новая методика анализа фракции «белки субмитохондриальных частиц», которая основана на получении подфракций: экстрамембранных и «экстрамембранных + трансмембранных» триптических пептидов. При идентификации белков подфракций учитывался не только специфичный гидролиз трипсином полипептидных цепей по связям Lys-X и Arg-X, но и возможный неспецифический. Это дало возможность получить несколько независимых выборок пептидов, что повысило достоверность при поиске белков по базам данных и, в конечном счёте, привело к увеличению числа идентифицированных белков, в том числе и гидрофобных. Проведен протеомный анализ мха Physcomitrella patens. Методами биоинформатики охарактеризованы белковые ансамбли гаметофоров, протонемы и протопластов. Впервые успешно осуществлен широкомасштабный поиск и идентификация новых пептидов в клетках и тканях растительного объекта. Для тестирования и анализа биологической активности пептидов, идентифицированных в клетках и тканях мха Physcomitrella patens, разработаны модельные системы на основе спор, протопластов, протонемы и гаметофоров. Установлено, что пептиды мха могут проявлять активность на разных этапах развития мхов от прорастания спор до роста гаметофоров. Пептиды, структура которых была установлена нами при использовании Q-TOF масс-спектрометрии и опубликована (Скрипников и др. 2011), были синтезированы твердофазным методом и использованы для исследования их биологической активности. Исследована биологической активности серии пептидов мха с использованием спор как лабораторного объекта - мха Physcomitrella patens, так и природного - Atruchum undulatum. Работа с A. undulatum ведется на базе Звенигородской биостанции МГУ в круглогодичном режиме. Установлено, что пептиды зеленых мхов могут проявлять физиологическую активность на ранних этапах развития протонем мхов из спор. Для исследования клеточной активности пептидов мха были разработаны специальные методы культивирования и последующего изучения протопластов мха методами флуоресцентной микроскопии. В процессе выполнения данного этапа исследования были установлены фоторегуляторные механизмы активации цитокинетических процессов, а также их торможения. Таким образом были созданы условия для работы с синхронизированными клеточными популяциями. Впервые было установлено, что пептиды зеленых мхов могут влиять на процессы делений клеток. Установленные закономерности открывают возможности для более детального изучения возедействия пептидов на процесс прохождения клеточного цикла с использованием флуоресцентной микроскопии для анализа реорганизации цитоскелета. Впервые в кчачестве более сложной модели для изучения биологической активности пептидов нами была использована культура гаметофоров. Установлено, что пептиды могут существенно влиять на процесс ветвления гаметофоров на искусственной среде. Показано, что культура гаметофоров мхов может быть использована как для биоморфологического изучения действия пептидов, так и для изучения их роли в генерации фототропических и гравитропических реакций, а также для исследования взаимодействия этих двух векторных факторов. В ходе космических экспериментов на борту биоспутников Бион М №1 (2013) и фотон М №4 (2014) было продемонстрировано наличие гравитропических и фототропических реакций у гаметофоров зеленых мхов при освещении светом различного спектрального состава, а также сравнительное воздействие грави- и фототропического стимулов на изгиб побегов мха Physcomitrella patens; впервые установлен гравитропичный рост гаметофоров зеленых мхов на дальнем красном свету (730 нм); впервые обнаружено подавление фототропических реакций побегов мха, индуцированных дальним красным (730 нм) светом под действием вектора силы тяжести. Полученные результаты будут использованы в дальнейших экспериментах для изучения роли пептидов в фототропизме и гравитропизме растений.