ИСТИНА

Феномен импорта РНК в митохондрии показан лишь у нескольких групп эукариот (простейшие, дрожжи, высшие растения, млекопитающие). Молекулярные механизмы этого процесса абсолютно видоспецифичны; также сильно разнится от вида к виду набор импортируемых молекул РНК. Так, в митохондрии пекарских дрожжей Saccaromyces cerevisiae импортируются, по последним данным, лишь три транспортных тРНК - лизиновая и две глютаминовых. Далее мы будем говорить только об импорте лизиновой тРНК, поскольку глютаминовые тРНК, если они и импортируются (вообще говоря, многие ученые ставят этот факт под сомнение), то по совершенно другим механизмам. Группы российских и французских ученых, сформировавшие в 2011 году Международную ассоциированную лабораторию, в рамках которой подается настоящая заявка, совместно изучают процесс импорта лизиновой тРНК в митохондрии дрожжей вот уже в течение 20 лет. За это время нами было получено множество данных относительно данного явления, но говорить о полном описании молекулярных механизмов импорта мы пока не можем. С другой стороны, мы показали, что дрожжевые тРНК и их производные могут импортироваться в митохондрии клеток человека (человеческие транспортные РНК в митохондрии не импортируются), и при этом можно добиться супрессии мутаций в генах изоакцепторых митохондриальных тРНК, являющихся причиной тяжелых наследственных заболеваний человека. Помимо этого, заинтересовавшись вопросом об импорте других типов РНК в митохондрии клеток человека, мы исследовали процесс импорта 5S рибосомной РНК в человеческие митохондрии, идентифицировали белковые факторы этого процесса и показали, что данную молекулу можно использовать в качестве "вектора" для направленной доставки гетерологических РНК в митохондрии. Более того, в соответствии с нашими предварительными данными, молекула 5S рРНК входит в состав митохондриальных рибосом человека (что опровергает полученные около 25 лет назад данные криоэлектронной микроскопии). Данный проект является логическим продолжением проведенных в наших группах ранее работ и направлен на: 1. Описание молекулярных механизмов импорта лизиновой тРНК в митохондрии дрожжей; 2. Исследование импорта 5S рибосомной РНК в митохондрии клеток человека и ее функции в органеллах; 3. Дальнейшее развитие систем доставки гетерологических РНК в митохондрии клеток человека для супрессии мутаций в митохондриальном геноме.

1. Показано, что альфа-енолаза человека способна функционально заменять енолазу-2 дрожжей в процессе импорта тРНК в митохондрии, тогда как бета- и гамма-енолазы не компетентны в этом процессе. 2. Показано, что порин-2 дрожжей принимает участие в импорте тРНК в митохондрии. Через этот канальный белок тРНК импортируется как минимум с такой же эффективностью, как и через белок Tom40 (канальный компонент аппарата транспорта белков в митохондрии). 3. Показано, что в митохондриях клеток человека 5S рРНК ассоциирована с большой субъединицей митохондриальных рибосом. 4. Мы получили штаммы дрожжей с делециями генов некоторых белков-компонентов аппарата импорта белков в митохондрии и рассчитали эффективность импорта тРНК в митохондрии таких штаммов. Данную задачу осложнял тот факт, что делеции генов большинства таких белков приводят к полной потере функциональности митохондрий. В связи с этим, в данном эксперименте мы делетировали гены только тех белков, наличие которых не является строго обязательным для нормальной работы органелл. В большинстве случаев (Tom71p, Tom22p, Tom6p) такие делеции приводили к снижению эффективности импорта. Однако отсутствие белка Tom5p, напротив, стимулировало импорт тРНК в митохондрии дрожжей. Помимо этого, мы делетировали ген белка-канала Tom40p. Хотя такая делеция приводит к потере митохондриальной функции, импорт тРНК в дефектные митохондрии все же был детектирован нами. Это говорит о том, что во внешней мембране дрожжевых митохондрий существует как минимум еще один канал для импорта тРНК. Такой канал был нами идентифицирован; им оказался порин, или вольтаж-зависимый анионный канал (VDAC). В соответствии с нашими результатами, тРНК может пересекать внешнюю митохондриальную мембрану либо через Tom40p, либо через порин. В последнем случае аппарат импорта белков в митохондрии не в процессе не задействован. Интересно также, что при импорте тРНК через порин данный процесс не требует наличия растворимых белковых факторов, которые совершенно необходимы для импорта тРНК по пути транспорта белков. 5. Ранее нами и нашими французскими коллегами был экспериментально показан импорт 5S рРНК в митохондрии клеток человека и установлены элементы первичной и вторичной структуры молекулы, необходимые для ее проникновения в органеллы. Интересно, что один из доменов 5S рРНК оказался совершенно не вовлеченным в процесс импорта: любые мутации, вносимые в нуклеотидную последовательность, формирующую данный домен, не приводили к значимому изменению эффективности импорта мутантных молекул в митохондрии. Следовательно, в эту часть молекулы 5S рРНК можно вставить гетерологическую последовательность нуклеотидов, которая будет доставляться в митохондрии в составе импортируемой молекулы. Такой подход можно использовать, например, для направленной доставки в митохондрии нуклеиновых кислот, которые будут связываться с мутантными участками митохондриальной ДНК по принципу антисмыслового взаимодействия и блокировать ее репликацию. В рамках данной работы были созданы мутантные версии 5S рРНК, содержащие вставки, комплементарные последовательностям митохондриального генома, образующимся в результате патогенных делеций. Мы показали, что такие 5S рРНК в стабильно трансфицированных человеческих клетках нормально экспрессируются, экспортируются из ядра и проникает в митохондрии. В настоящее время мы проводим работы по оценке эффективности подавления патогенных мутаций в результате экспрессии генов данных РНК в клетках человека (результаты будут получены на третьем году выполнения проекта).