ИСТИНА

Вирус иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ-1) вызывает медленно прогрессирующее заболевание иммунной системы, которое без терапии может привести к синдрому приобретенного иммунодефицита и смерти пациента. Изучение механизмов репликации и взаимодействия ВИЧ-1 с клеткой продолжается уже более 30 лет. За это время было разработано несколько десятков антивирусных препаратов, действующих на разные вирусные мишени, а также режимов их применения в составе комбинированной терапии, что позволило ВИЧ-инфицированным пациентам жить полноценной жизнью десятки лет с момента постановки диагноза. Однако тот факт, что вирус встраивает копию своего генома в клеточную ДНК, заставляет использовать антиретровирусную терапию на протяжении всей жизни пациента. Неточность обратной транскриптазы ВИЧ-1 приводит к появлению в организме пациентов вариантов вируса, устойчивых к одному или нескольким препаратам, что вынуждает менять терапию. Если раньше такие штаммы вирусов появлялись лишь в организме пациентов, длительно принимающих определенную комбинацию препаратов, сегодня лекарственно-устойчивые штаммы детектируют у наивных пациентов, которым диагноз ставят впервые. Это говорит о выходе таких вариантов вируса в популяцию, и при продолжении этой тенденции используемая сегодня терапия может стать неэффективной. Именно поэтому важно продолжать исследования механизмов репродукции этого вируса и особенно, его взаимодействия с клеточными системами. Это позволит определить новые терапевтически-значимые мишени и создать новые типы антиретровирусных препаратов. Клетки любых организмов обладают широким спектром систем защиты от патогенов. Основу этих систем составляют рецепторы патоген-ассоциированных молекул. В последнее десятилетие удалось обнаружить такие рецепторы для находящейся в цитозоли двуцепочечной ДНК. Одним из ключевых рецепторов является белок cGAS, запускающий интерфероновый ответ через cGAS-STING-путь. Поскольку жизненный цикл ВИЧ-1 проходит через стадию обратной транскрипции, т.е. синтез двуцепочечной ДНК-копии геномной РНК вируса в цитоплазме инфицированной клетки, были высказаны предположения, что ВИЧ-1 также может стимулировать внутриклеточный иммунитет через cGAS-STING-путь. Эти предположения были подтверждены экспериментально. Однако этот ответ был не таким сильным, как в случае других родственных ретровирусов, что говорит о наличии у ВИЧ-1 защитных механизмов противодействия внутриклеточному иммунитету. Один из таких механизмов – неполная разборка капсида вируса в цитоплазме, что не дает рецепторам взаимодействовать с синтезированной кДНК и активировать интерфероновый ответ. Другой потенциальный механизм – взаимодействие капсида и/или вирусной кДНК с клеточными белками, блокирующими активацию cGAS-STING-пути. В настоящем проекте будут изучаться два аспекта взаимодействия ВИЧ-1 с системой детекции двуцепочечной цитозольной ДНК. В рамках первого направления будет исследовано, как связана стабильность капсида ВИЧ-1 с активацией интерферонового ответа. В частности, с использованием серии лентивирусных вектором на основе ВИЧ-1 с разным размером генома будет изучено, как напряжение капсида, возникающее при синтезе более жесткой по сравнению с РНК двуцепочечной кДНК, влияет на способность детектировать цитозольную ДНК. Также будут выявлены мутации, дестабилизирующие капсид, и изучен их эффект на активацию cGAS-STING-пути. Помимо этого, планируется идентификация клеточных белков, взаимодействующих с интактным капсидом ВИЧ-1, которые могут влиять на его стабильность и, как следствие, активацию указанного пути внутриклеточного иммунитета. Для идентифицированных белков будет изучен механизм их влияния на ВИЧ-инфекцию. В рамках второго направления с помощью полногеномного CRISPR-Cas9 скрининга будет осуществлен поиск белков, которые важны для активации интерферонового ответа по cGAS-зависимому пути в ответ на заражение клетки вирусом, с последующим изучением механизма участия в этом процессе нескольких найденных факторов.

Human immunodeficiency virus (HIV) causes a slowly progressive disease of the immune system, which without therapy can lead to acquired immunodeficiency syndrome and death of the patient. The study of the mechanisms of its replication and interaction with the cell has been ongoing for more than 30 years. During this time, several dozen antiviral drugs have been developed that act on different viral targets, as well as regimens for their use in combination therapy, which has allowed HIV-infected patients to live a full life for decades from the moment of diagnosis. However, the fact that the virus integrates a copy of its genome into cellular DNA leads to the need to use antiretroviral therapy throughout the patient's life. Inaccuracy of HIV-1 reverse transcriptase leads to the appearance in the body of patients of variants of the virus that are resistant to one or more drugs, which forces a change in therapy. If earlier such strains of viruses appeared only in the patients who had been taking a certain combination of drugs for a long time, today such strains are detected in naive patients who are diagnosed for the first time. This indicates the emergence of resistant variants of the virus in the population, and if such trend continues, the therapy used today may become ineffective. That is why it is important to continue research into the mechanisms of reproduction of this virus and, in particular, its interaction with cellular systems. This will allow us to identify new therapeutically significant targets and create new types of antiretroviral drugs. Cells of any organism have a wide range of intracellular protective mechanisms against pathogens. The basis of these systems are receptors of pathogen-associated molecules. In the last decade, such receptors for cytosolic double-stranded DNA have been discovered. One of the key receptors is the cGAS protein, which triggers the interferon response via the cGAS-STING pathway. Since the life cycle of HIV-1 goes through the stage of reverse transcription, i.e. the synthesis of a double-stranded DNA copy of the RNA genome in the cytoplasm of the infected cell, it was suggested that HIV-1 can also stimulate intracellular immunity via cGAS-STING. These suggestions were confirmed experimentally. However, this response was not as strong as in the case of other related retroviruses, which indicates that HIV-1 has protective mechanisms to counteract intracellular immunity. One such mechanism is incomplete disassembly of the viral capsid in the cytoplasm, which prevents receptors from interacting with it and activating the interferon response. Another potential mechanism is the interaction of the capsid and/or viral cDNA with cellular proteins that block activation of the cGAS-STING pathway. In this project, we will study two aspects of HIV-1 interaction with the double-stranded cytosolic DNA sensors. The first direction will study how the stability of the HIV-1 capsid is related to the activation of the interferon response. In particular, using a series of lentiviral vectors based on HIV-1 with different genome sizes, we will study how the capsid tension arising during the synthesis of double-stranded cDNA, which is more rigid than RNA, affects the ability to detect cytosolic DNA. Mutations that destabilize the capsid will also be identified and their effect on the activation of the cGAS-STING pathway studied. In addition, it is planned to identify cellular proteins interacting with intact HIV-1 capsids, which can affect its stability and, as a result, the activation of this pathway of intracellular immunity. The mechanism of influence of the identified proteins on HIV infection will be studied. In the second direction, a search will be carried out using genome-wide CRISPR-Cas9 screening to identify proteins that are important for activating the interferon response via the cGAS-dependent pathway in response to HIV-1, followed by a study of the mechanism of participation in this process of several identified factors.

В результате проведения исследования будут достигнуты следующие цели: 1. Будет установлено, как напряжение капсида ВИЧ-1, возникающее при обратной транскрипции геномной РНК, влияет на активацию путей детекции цитоплазматической ДНК. 2. Будут идентифицированы мутации, дестабилизирующие капсид ВИЧ-1 и установлена взаимосвязь этих мутаций со способностью активировать пути детекции цитозольной ДНК. 3. Будут идентифицированы клеточные белки, взаимодействующие с капсидом ВИЧ-1, и потенциально способные модулировать пути детекции цитозольной ДНК (активировать или маскировать кДНК ВИЧ-1 от сенсинга). Для наиболее интересных находок будет изучен механизм их участия в регуляции репликации вируса. 4. Будут идентифицированы клеточные белки, необходимые для детекции цитозольной ДНК ВИЧ-1 и активации cGAS-STING-пути. Для наиболее интересных находок будет исследован механизм их влияния на репликацию ВИЧ-1. Полученные данные в будущем могут стать основой для создания новых типов терапии ВИЧ-инфекции, активирующей внутриклеточные системы защиты от патогенов. Второе потенциальное практическое применение полученных в ходе реализации проекта результатов может заключаться в повышении эффективности доставки генетического материала векторами на основе генома ВИЧ-1. Лентивирусные векторы на основе ВИЧ-1 сегодня все больше используются как в лабораторной практике, так и в медицине (генно-терапевтические препараты, CAR-T-терапия и другие). Активация внутриклеточного иммунитета при данных типах воздействия имеет негативный эффект, поэтому понимание механизмов его активации и регуляции может позволить создать препараты, повышающие эффективность проводимых манипуляций с клетками.

Коллектив под руководством А.Н. Анисенко обладает многолетним успешным опытом изучения ранних этапов репликации ВИЧ-1: обратной транскрипции, интеграции и пост-интеграционной репарации. Исследуется структура интегразы ВИЧ-1, её взаимодействие с вирусной и клеточной ДНК, а также роль клеточных белков (Ku70, Ku80, DNA-PKcs и др.). Разработан ингибитор взаимодействия интегразы ВИЧ-1 с белком Ku70, подавляющий репликацию вируса. Работы поддержаны грантами РНФ. Для реализации нового проекта в лаборатории налажены ключевые методики: работа с моноцитарной линией THP-1, её трансдукция лентивирусными векторами на основе ВИЧ-1 и детекция активации cGAS-STING-пути. Подтверждено, что активация интерферонового ответа зависит от синтеза кДНК обратной транскриптазой и активности киназы TBK1. Коллектив имеет большой опыт генно-инженерных работ, создания векторов экспрессии и работы с рекомбинантными белками. Налажена сборка репликативно-некомпетентных репортерных векторов на основе ВИЧ-1 и детекция ранних этапов инфекции.

В результате выполнения проекта будут установлены фундаментальные основы распознавания кДНК ВИЧ-1 клеточными системами ответа на цитозольную ДНК, а также, механизмы регуляции распознавания вирусной кДНК клеточными белками. В зависимости от того, какие белки будут найдены, в дальнейшем можно будет говорить о разработке ингибиторов белков, которые взаимодействуя с капсидом ВИЧ-1 максируют вирусную кДНК от распознавания и запуска интерферонового ответа. Эти работы позволят создать новый класс ингибиторов ВИЧ-1, которые могут стать основой для создания новых анти-ВИЧ-препаратов.