ИСТИНА

Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) являются основной причиной смертности. Разработка методов их диагностики и терапии является актуальной социально важной задачей. Развитие этих патологий связано с нарушением микроциркуляции крови (МЦ). Проект посвящен комплексному изучению изменений параметров МЦ и типичных биомаркеров, влияющих на текучесть крови, перфузию тканей и их оксигенацию. Набор характерных биомаркеров МЦ включает вязкость крови, вязкость плазмы, гематокрит и концентрацию фибриногена, индекс агрегации и деформации эритроцитов, функции эндотелия и др. Отклонения данных биомаркеров от нормы отражают состояние пациентов с ССЗ и могут быть надежными предикторами осложнений течения болезни, а также индикаторами эффективности проводимой терапии. Будет установлена взаимосвязь изменений этих биомаркеров, измеряемых in vitro, с параметрами МЦ, измеряемыми in vivo. Будет определена роль эндотелиальных клеток, микрореологии эритроцитов, газотрансмиттеров, белкового состава плазмы крови в изменениях микрососудистой перфузии тканей у здоровых и больных лиц. Впервые будет проведено изучение механизмов влияния сосудистого эндотелия на течение крови в микроканалах, которое включает выявление роли прямого микромеханического взаимодействия клеток крови и эндотелиацитов в потоке, а также анализ роли важных паракринных регуляторов и модуляторов этого взаимодействия. Будут сформированы группы испытуемых со следующим заболеваниями: хроническая сердечная недостаточность, артериальная гипертония, атеросклероз артерий нижних конечностей. Комплекс экспериментальных методов будет включать измерения микрореологических параметров крови как на уровне отдельных клеток, так и на уровне образцов цельной крови и суспензий эритроцитов с использованием современных оптических методов и подходов искусственного интеллекта (ИИ). Эти эксперименты будут проводиться in vitro с образцами крови в статике и / или в условиях потока в каналах микрофлюидики, поверхности которых будут покрыты клетками сосудистого эндотелия для обеспечения физиологически более релевантной модели течения крови. Измерения параметров МЦ и функции эндотелия будут проводиться in vivo с использованием метода лазерной доплеровской флоуметрии. Будут получены новые фундаментальные сведения о роли сосудистого эндотелия, газотрансмиттеров и молекулярно-белкового состава плазмы крови в регуляции МЦ и перфузии тканей. Это позволит сформулировать рекомендации по коррекции важных для нормализации МЦ биомаркеров при терапии заболеваний. Практическое значение проекта заключается в возможности применения наколенного в ходе выполнения Проекта массива данных для обновления протоколов коррекции микрореологических нарушений у пациентов с ССЗ. Это создает базу для усовершенствования современных клинических методов диагностики состояния пациентов и мониторинга терапии. Будет разработана технология изготовления эндотелизированных микрофлюидных чипов в качестве платформы для in vitro исследований кровотока в физиологически релевантных условиях, а также разработка программного продукта для характеристики микрореологических параметров крови и определения состава плазмы на основе алгоритмов ИИ. Разработанное в рамках Проекта программное обеспечение позволит проводить моделирование и предсказание изменений вязкости крови при заданных значениях большого числа микрореологических параметров пациентов с целью составления индивидуального плана лечения. Этот мультидисциплинарный Проект будет реализован группой физиков, биологов и медиков МГУ им. М.В. Ломоносова и Ярославского педагогического университета им. К.Д. Ушинского, представленной как ведущими специалистами мирового уровня, так и молодыми учёными, студентами и аспирантами, работающими в области биомедицинской фотоники и применения оптических технологий в исследовании живых систем, микроциркуляции, гемореологии и кардиологии.

Cardiovascular diseases (CVD) are the leading cause of death. The development of methods for its diagnosis and therapy is an urgent socially important task. The development of these pathologies is associated with impaired blood microcirculation (MC). The project is devoted to a comprehensive study of changes in MC parameters and typical biomarkers affecting blood fluidity, tissue perfusion and its oxygenation. The set of characteristic MC biomarkers includes blood viscosity, plasma viscosity, hematocrit and fibrinogen concentration, erythrocyte aggregation and deformability indices, endothelial functions, etc. Deviations of these biomarkers from the norm reflect the condition of patients with CVD and can be reliable predictors of complications in the course of the disease, as well as indicators of the effectiveness of the therapy. The relationship between changes in these biomarkers measured in vitro and MC parameters measured in vivo will be established. The role of endothelial cells, red blood cell microrheology, gas transmitters, and plasma protein composition in changes in tissue microvascular perfusion in healthy and sick individuals will be determined. For the first time, a study of the mechanisms of the vascular endothelium's influence on blood flow in microchannels will be conducted, which includes identifying the role of direct micromechanical interaction of blood cells and endothelial cells in the flow, as well as analyzing the role of important paracrine regulators and modulators of this interaction. Groups of subjects with the following diseases will be formed: chronic heart failure, arterial hypertension, atherosclerosis of the arteries of the lower extremities. The set of experimental methods will include measurements of blood microrheological parameters both at the level of individual cells and at the level of whole blood samples and erythrocyte suspensions using modern optical methods and artificial intelligence (AI) approaches. These experiments will be conducted in vitro with blood samples in static and/or flow conditions in microfluidic channels which surfaces will be coated with vascular endothelial cells to provide a more physiologically relevant model of blood flow. Measurements of MC parameters and endothelial function will be performed in vivo using laser Doppler flowmetry. New fundamental data will be obtained on the role of vascular endothelium, gas transmitters and molecular-protein composition of blood plasma in the regulation of MC and tissue perfusion. This will allow the formulating of recommendations for the correction of biomarkers important for the normalization of MC in the treatment of diseases. The practical significance of the project lies in the possibility of using the data array accumulated during the implementation of the Project to update the protocols for the correction of microrheological disorders in patients with CVD. This creates a basis for improving modern clinical methods for diagnosing the condition of patients and monitoring therapy. A technology for manufacturing endothelialized microfluidic chips as a platform for in vitro studies of blood flow under physiologically relevant conditions will be developed, as well as a software product for characterizing microrheological parameters of blood and determining plasma composition based on AI algorithms. The software developed within the framework of the Project will allow modeling and predicting changes in blood viscosity at given values of a large number of microrheological parameters of patients in order to create an individual treatment plan. This multidisciplinary Project will be implemented by a group of physicists, biologists and physicians from Lomonosov Moscow State University and K.D. Ushinsky Yaroslavl Pedagogical University, represented by both leading world-class specialists and young scientists, students and postgraduates working in the field of biomedical photonics and the use of optical technologies in the study of living systems, microcirculation, hemorheology and cardiology.

Планируемые результаты: 1-ый год ------------ 1.Будут разработаны и утверждены критерии включения и исключения пациентов, страдающих рассматриваемыми заболеваниями: АГ, ХСН и ААН, а также здоровых доноров. 2.Будет разработан и утвержден дизайн экспериментов и экспериментальные протоколы для исследования микрореологических свойств крови, микроциркуляции, системы гемостаза и функции эндотелия. 3.Будет получено разрешение этического комитета МГУ на проведение всего комплекса экспериментальных исследований со здоровыми добровольцами и пациентами с АГ, ХСН и ААНК, а также с образцами их крови. 4.Будут закуплены материалы и оборудование, необходимые для выполнения Проекта. 5. Будут проведены калибровочные измерения для всего оборудования, применяемого для выполнения Проекта. 6.Будут разработаны микрофлюидные чипы, моделирующие сосуды (в том числе с покрытием эндотелиальными клетками) для измерений микрореологических параметров клеток крови в различных средах. 7.Будут исследованы используемые экспериментальные методы на чувствительность и специфичность к измерению микрореологических параметров крови, микроциркуляции, системы гемостаза и функции эндотелия здоровых и больных лиц. 8. Будут проведены предварительные эксперименты по измерению микрореологических характеристик эритроцитов здоровых и больных лиц, апробировано применение алгоритмов ИИ для обработки массивов данных изображений агрегации и деформируемости эритроцитов с целью поиска отличий от нормы, характерных для этих заболеваний: a) будут измерены параметры агрегационной кинетики клеток крови (эритроцитов) на ансамбле клеток и на одиночных клетках: индекса агрегации, характерного времени агрегации, а также силы агрегации и дезагрегации при образовании парных агрегатов. Будут установлены и проанализированы параметры агрегационных кинетик эритроцитов. б) будут измерены параметры гидродинамической прочности эритроцитарных агрегатов в терминах сдвиговых напряжений (критического сдвигового напряжения). б) будет проведена оценка изменения деформационных параметров, механических свойств мембраны и вязкости внутриклеточного содержимого эритроцитов с помощью лазерной дифрактометрии. г) будут получены: (1) данные регистрации параметров гемореологического профиля (десять основных гемореологических параметров: вязкости крови при высоких и низких скоростях сдвига, вязкости плазмы, вязкости суспензии эритроцитов, их агрегации и деформируемости, соотношение альбуминов и глобулинов плазмы, концентрация фибриногена, МСНС и отношения гематокрит/вязкость крови), (2) характеристики системы гемокоагуляции (методом коагулографии в сочетании с регистрацией агрегации тромбоцитов), (3) показатели микроциркуляции методом ЛДФ у здоровых лиц и больных АГ, ХСН и ААНК. 9. Будут измерены параметры микроциркуляции, тканевой перфузии и активности метаболизма методом лазерной доплеровской флоуметрии (ЛДФ) и, в том числе, с использованием новой технологии – носимых устройств, размещенных на разных частях тела и параллельной регистрацией ЛДФ-грамм с этих точек. Будет исследована функция сосудистого эндотелия у здоровых и больных лиц методом ЛДФ при проведении окклюзионной пробы и пробы с электрофоретической аппликацией ацетилхолина на кожу. Будет апробирована методика дистанционного (удаленного) прекондиционирования микрокровотока в сосудах кожи голени здоровых лиц и больных АГ, ХСН и ААНК. 10. Будет начато формирование баз данных для последующей обработки их алгоритмами машинного обучения; 11. Будет разработано ПО для обработки с помощью алгоритмов ИИ изображений эритроцитов в потоке, полученных в проточной камере, с целью вычисления кинетик агрегации и распределений клеток по деформируемости у здоровых лиц и больных АГ, ХСН и ААНК. 12. Будет проведён набор тренировочных и валидационных данных для обучения моделей МО в размере не менее 500 изображений, полученных на крови у здоровых лиц и больных АГ, ХСН и ААНК. 13. Будет исследовано потенциальное пролиферативное/антипролиферативное воздействие газотрансмитеров (NO, H2S) на культуру эндотелиальных клеток с помощью MTT-теста при добавлении молекул-индукторов газотрансмиттеров. 14.Будет подготовлено и сделано минимум 2 доклада на профильных научных конференциях по результатам, полученным при выполнении Проекта. 15.Будет подготовлено к публикации минимум 2 статьи по результатам, полученным при выполнении Проекта. 2-ой год ------- 1.Будет экспериментально определён расширенный комплекс параметров гемореологического профиля здоровых лиц и больных АГ, ХСН и ААНК, включая измерение вязкости крови при низких и высоких напряжениях сдвига, вязкости плазмы, Hct, Hb, MCHC, MCV, RBCs (число эритроцитов) АЭ, ДЭ, общего белка плазмы, альбуминов и глобулинов (А/Г коэффициент). 3. Методами корреляционного и регрессионного анализа будет определён вклад в текучесть крови и микрососудистую перфузию разных параметров гемореологического профиля. Будут исследованы модели неньютоновского реологического поведения крови у здоровых лиц и больных АГ, ХСН и ААНК и определено влияние степени неньютоновости крови на ее кислородтранспортный потенциал и микрососудистую перфузию тканей. 3. На основе анализа вклада ключевых микрореологических характеристик эритроцитов в текучесть крови и ее транспортный потенциал будут разработаны экспериментальные способы восстановления негативно измененных деформируемости и агрегации эритроцитов у больных АГ, ХСН и ААНК путем воздействия на основные внутриклеточные сигнальные пути: 1) катионные каналы (кальциевые и калиевые); 2) аденилатциклазный сигнальный путь; 3) гуанилатциклазный сигнальный путь. 4. Будут разработаны и апробированы способы прекондиционирования: 1) на основе окклюзионной пробы с созданием ишемии/реперфузии на предплечье и регистрацией методом ЛДФ микрососудистой перфузии кожи предплечья (модель местного прекондиционирования) и тканевой перфузии в коже голени (модель дистантного прекондиционирования). 2) На эритроцитах у здоровых лиц и больных АГ, ХСН и ААНК будет исследована работа модели механического прекондиционирования микрореологических свойств эритроцитов путем нагружения суспензии эритроцитов постоянным напряжением сдвига (критерий эффективности: положительное изменение ДЭ и АЭ). 3) На эритроцитах у здоровых лиц и больных АГ, ХСН и ААНК будет исследована работа модели оксидативного прекондиционирования на основе инкубации эритроцитов с перекисным соединением, пероксидом водорода (Н2О2) в концентрации 100 мкМ, который создает окислительный стресс внутри эритроцита, действует на белки мембранного цитоскелета, и повышает модуль сдвига мембраны [J.P. Hale et al., 2011]. 4) Будет апробирован эффект предварительной инкубации эритроцитов с донором H2S, гидросульфидом натрия (NaHS) с последующим добавлением H2O2 как перекисного агента. При этом H2S проявляет прямую антиоксидантную способность и может нейтрализовать H2O2, образуя воду [C. Munteanu et al., 2023; X. Sun et al., 2024]. 5. Будет выполнена серия экспериментов по измерению микрореологических свойств крови, микроциркуляции, системы гемостаза и функции эндотелия для пациентов с АГ, ХСН и ААНК для заполнения разработанной базы данных, накопления информации, необходимой для статистического анализа результатов и применения алгоритмов машинного обучения. 6. Будут оценены изменения морфологических свойств эритроцитов при АГ, ХСН и ААНК с помощью проточной цитометрии. Будут выполнены измерения на группе здоровых добровольцев. 7. Будет проведен промежуточный статистический анализ накопленных данных и будут выявлены взаимосвязи изменений, связанных с заболеваниями. 8. Будут выявлены факторы, определяющие взаимодействия клеток крови между собой и с клетками эндотелия на основе вариации состава межклеточной среды (компонентов плазмы, газотрансмиттеров и пр.), а также при добавлении экзогенных факторов (ингибиторов специфического связывания фибриногена (в частности, тирофибан, РГДС, эптифибатид) и индукторов агрегации (высокомолекулярных макромолекул, в частности декстранов). 9.На основе статического анализа и анализа с использованием алгоритмов машинного обучения полученных данных вместе с классическими лабораторными показателями будут выявлены новые биомаркеры нарушений функций и возможные причинно-следственные связи изменений в состоянии микрореологических параметров, микроциркуляции, гемостаза и функции эндотелия. 10. Будет исследован метаболизм оксида азота и сероводорода у больных АГ, ХСН и ААНК, разных стадий заболевания тремя способами: (1) путем определения в плазме крови соотношения нитриты/нитраты и концентрации H2S, а также (2) на моделях микрореологических ответов интактных эритроцитов и их восстановленных тенях (в опытах in vitro) на действие доноров NO и H2S (нитропруссида натрия и гидросульфида натрия) и (3) регистрацией микроциркуляции методом ЛДФ в сочетании с фармакологическими пробами: электрофоретической аппликации донора NO нитропруссида натрия и неэндотелиального стимулятора вазодилатации – ацетилхолина. 11. Будет исследовано сочетанное взаимодействие газотрансмитеров, выделяемых молекулами-донорами газотрансмитеров, и оксида азота, выделяемого эндотелием, на микрореологические параметры эритроцитов методами лазерной агрегометрии на уровне ансамбля клеток и лазерного пинцета на уровне одиночных клеток. 12. Будет проведено обучение и настройка моделей МО на основе собранного массива тренировочных данных. 13. Будет верифицирован разработанный программный продукт на основе тестовых данных, полученных в экспериментах с образцами крови здоровых добровольцев и пациентов. 14. Будут выявлены статистически значимые отличия в вычисляемых параметрах в случае нормы и патологий. 15. Будет проведено моделирование и предсказание значения вязкости крови в зависимости от различных реологических параметров на основе анализа собранных данных. 16. Будет подготовлено и сделано минимум 4 доклада на профильных научных конференциях по результатам, полученным при выполнении Проекта. 17. Будет подготовлено к публикации минимум 3 статьи по результатам, полученным при выполнении Проекта. 3-ий год -------- 1. Будет выполнен анализ данных, полученных на 1 и 2 годах реализации программ исследования. 2. Будет выполнена рандомизация данных по полу и возрасту и, на этой основе, завершено формирования баз данных для их обработки алгоритмами машинного обучения. 3. Будет проведено исследование микрореологических характеристик эритроцитов, фракционированных по возрасту (на молодые, зрелые и старые клетки) в градиенте плотности среды Перколл [D.A.Bizjak et al., 2015] у здоровых лиц и больных АГ, ХСН и ААНК. 4. Будет выполнен сравнительный анализ микрореологических характеристик эритроцитов здоровых и больных лиц разного возраста без фракционирования клеток по возрасту и эритроцитов, разделенных в градиенте плотности на возрастные субпопуляции. 5. Будет выполнен сравнительный анализ определения вязкости крови расчетным способом на основе формул де Симоне (по данным клинических анализов гематокрита и общего белка плазмы больных и здоровых лиц) и результатов прямого измерения вязкости крови при высоких и низких скоростях сдвига методом ротационной и капиллярной вискозиметрии. 6. Будет подготовлена база данных (по результатам исследования, указанным в пункте 5, для обработки алгоритмами искусственного интеллекта с целью выявления степени информативности определения вязкости крови расчетным способом и возможности ее использования в клинической диагностике. 7. Будут выработаны рекомендации по учету выявленных закономерностей при лечении пациентов, страдающих АГ, ХСН и ААНК. 8. На основе полученных зависимостей количественно будут выделены наиболее важные факторы, влияющие на изменение характерных биомаркеров микроциркуляции крови при заболеваниях АГ, ХСН и ААНК. 9. Используя статистические методы и методы МО, будет количественно охарактеризовано синергетическое влияние эндотелия, газотрансмиттеров и клеточно-плазменных компонентов крови на изменение биомаркеров микрореологических параметров крови, измеряемых in vitro. 10. Будут связаны изменения характерных биомаркеров микрореологических параметров, полученные при измерениях in vitro, с изменениями характерных биомаркеров микроциркуляции крови, полученными при измерениях in vivo, при заболеваниях АГ, ХСН и ААНК. 11. Будет проведена государственная регистрация нового программного продукта по обработке изображений с проточной камеры с целью расчета микрореологических характеристик эритроцитов. 12. Будет подготовлено и сделано минимум 4 доклада на профильных научных конференциях по результатам, полученным при выполнении Проекта. 13.Будет подготовлено к публикации минимум 3 статьи по результатам, полученным при выполнении Проекта.

Проект под руководством к.ф.-м.н. А.Е. Луговцова объединяет специалистов разного уровня и профиля – сотрудников, аспирантов и студентов лаборатории «Биомедицинской фотоники» (зав. лабораторией к.ф.м.н. А.В. Приезжев) и отделения кардиологии Медицинского научно-образовательного института МГУ (зав. отделения, к.м.н. Л.И. Дячук), а также лабораторий «Прикладной физиологии» (зав. лабораторией д.б.н. А.В. Муравьев) и «Реологии крови и гемостаза» (зав. лабораторией д.б.н. И.А. Тихомирова) Ярославского педагогического университета им. К.Д. Ушинского. Участники Проекта обладают более, чем 20-летним опытом проведения совместных междисциплинарных исследований на стыке физики, биологии и медицины при тесном сотрудничестве физиков, биологов и медиков. В частности, это касается работ по определению биомеханических и реологических параметров клеток человека и животных, параметров микроциркуляции и функции эндотелия, а также биофизики системы гемостаза. Часть этих совместных исследований выполнялась в рамках межфакультетского научного проекта МГУ «Оптика крови в норме и патологии», а также нескольких успешно завершенных научных проектов, поддержанных РФФИ и РНФ. При этом был приобретен ценный̆ опыт сотрудничества, получен научный и методический задел, необходимый для выполнения данного Проекта.

Общим итогом выполнения Проекта будут результаты комплексного исследования фундаментальных биофизических процессов в крови и тканях, перфузируемых кровью при сердечно-сосудистых заболеваниях и с использованием методов искусственного интеллекта