| Результаты этапа: Было проведено масштабирование методики синтеза конъюгата PKA-49. Было установлено, что для наработки конъюгата целесообразнее использовать классический пептидный синтез в растворе, нежели твердофазный синтез. Было получено 263 мг целевого вещества. Осуществлён аналитический контроль получаемого при масштабировании конъюгата методом ВЭЖХ-МС (100% в положительном токе), оценена радиохимическая чистота 98,13%. Соединения будут описаны с применением других методов физико-химического анализа (ЯМР-спектроскопия 1H)
В ходе работы был проведен скрининг серии из 8 лигандов с терминальной азидной группой на клеточной линии LNCaP. Серия была получена с применением твердофазного синтеза. Все модифицированные лиганды оказались более активны, чем вектор-молекулы DCL и 2-PMPA. Также было получено 4 новых лиганда с орто-нитробензильным заместителем при ε-атоме азота лизина с терминальной азидной группой и исследована аффинность лигандов на клеточной линии LNCaP.
Был проведен синтез конъюгата с новой дипептидной частью в линкере, скомбинировав линкерные части двух наиболее аффинных лигандов, так как от аффинности лигандов зависят их фармакокинетические параметры. Конъюгат PSIO-11 был получен с выходом 56% для дальнейшего исследования аффинности и радиомечения.
Было получено 2 конъюгата с введенными в структуру лигандов ПСМА линкеров на основе полиэтиленгликоля. Это позволяет увеличить водорастворимость целевых конъюгатов, а также сместить показатель LogP в более гидрофильную область.
Были синтезированы конъюгаты, содержащие липофильные борные кластеры — карбораны и металлокарборановый фрагмент бисдикарболлида кобальта, которые могут служить заменой классических альбумин-связывающих мотивов. Конъюгаты получены с помощью реакции азид-алкинового циклоприсоединения с модифицированным кобальт(бисдикарболлидом). Для исследования реакции азид-алкинового циклоприсоединения между лигандами и данным соединением была проведена пробная реакция с лигандом сравнения с получением соответствующего конъюгата. Получено три новых конъюгата, направленных к ПСМА и содержащих в своей структуре борные кластеры.
Был проведен синтез новых векторных молекул, содержащих при ε-атоме азота лизина хинолин-2-, хинолин-3-, хинолин-4-метильный фрагмент для увеличения аффинности к белковой мишени ПСМА. Новый конъюгат TSM-3 был получен с фрагментом хинолина, что структурно похоже на фрагмент нафтилаланина в структуре PSMA-617.
Был получен бимодальный конъюгат PS-205 с флуоресцентной меткой SulfoCy5 и хелатирующим агентом DOTA. Была синтезирована серия конъюгатов с нестероидными противовоспалительными препаратами, а именно: ибупрофеном, флурбипрофеном, кетопрофеном, диклофенаком, этодолаком и др. В ходе работы получено 10 конъюгатов с альбумин-связывающими структурами. Конъюгаты охарактеризованы методами ЯМР 1H, LCMS, HRMS. Проведена оценка радиохимической чистоты для 10 конъюгатов с хелатирующим агентом DOTA. Радиохимическая чистота получаемых препаратов составляла более 90% согласно ВЭЖХ.
Осуществлена оценка функциональной пригодности in vitro радиофармацевтических конъюгатов лигандов ПСМА. Среди 12 исследованных конъюгатов выявлена группа соединений, превосходящая по общее накоплению и интернализации эталонный препарат PSMA-11. Были определены коэффициенты липофильности (logD) для 12 новых конъюгатов ПСМА.
Результаты оценки функциональной пригодности in vitro хорошо согласуются с данными по липофильности. Комплексный анализ данных позволяет с высокой долей уверенности рекомендовать PS-165, PS-161 и AY-325 для дальнейших исследований in vivo. Данные по их изучению предсказывают высокую диагностическую и потенциальную терапевтическую эффективность.
На мышиных моделях были оценены ключевые параметры фармакокинетики и биораспределения наиболее оптимальных по данным in vitro конъюгатов с радиоизотопом 68Ga. VT-53 и VT-54 были выделены как конъюгаты лидеры для для дальнейших расширенных биологических испытаний.
Проведено исследование на мышах, включающее оценку общего состояния и роста опухоли. Подкожные ксенографты LNCaP начали визуализироваться и прощупываться на 29ый день после трансплантации клеток. Объемы опухолей на момент исследования биораспределения варьировались от 100 до 300 мм3.
Результаты гистологического исследования образцов опухолей LNCaР: фрагменты жировой и поперечно-полосатой мышечной ткани с ростом узлов опухоли представленной солидными пластами из крупных атипичных клеток с эозинофильной цитоплазмой, выраженно полиморфными ядрами, в части из которых различимы ядрышки, с большим количеством митозов. Заключение: Низкодифференцированная карцинома. Определить гистогенез опухоли на срезах, окрашенных гематоксилином и эозином, не представляется возможным.
Выбранные модели патологии были успешно воспроизведены на лабораторных мышах. Приживаемость клеток LNCaP составила 75%. Рост и наличие опухолевых очагов наблюдался визуально и был подтвержден гистологическим исследованием образцов пораженных тканей.
Произведена первичная оптимизация вводимых концентраций и радиационных доз. Конъюгат [177Lu]Lu-PKA-49 демонстрирует фармакокинетический профиль, перспективный для радионуклидной терапии.
Матрица факторов дозы наглядно отражает физику взаимодействия бета-излучения лютеция-177 с тканью: предельно локализованное воздействие, где основным детерминантом дозы является накопление препарата в самой мишени, а второстепенную, но требующую учета роль играет облучение от ближайших соседей, в то время как вклад от остального организма пренебрежимо мал.
Для оценки терапевтической эффективности конъюгата PKA-49, меченного радиоизотопом лютеция-177, была разработана и обоснована методология экстраполяции терапевтических доз с человека на мышь. Наиболее реалистичной и биологически обоснованной была признана активность в диапазоне 35-45 МБк на мышь, что обеспечивает формирование в опухоли дозы около 4 Гр.
Проделанная работа представляет собой цикл обоснования использования определенных вводимых активностей [177Lu]Lu-PKA-49 в организм мышей для формирования терапевтического эффекта. Полученные результаты – от характеристик биораспределения до расчетов поглощенных доз и методологии межвидовой экстраполяции – свидетельствуют о перспективности данного конъюгата для радионуклидной терапии рака предстательной железы. |
