ИСТИНА

Научная проблема, на решение которой направлен проект, связана с выяснением молекулярных механизмов направленной регуляции антибактериальной активности бактериолитических белков молока биологически активными добавками и использование полученных знаний для использования в практике молочного животноводства и совершенствования продуктов питания. В составе молока присутствует антибактериальный фермент лизоцим, разрушающий клетки бактерий [1,2]. Лизоцим изучают очень давно, однако в последние годы появилась совершенно новая информация, что данный белок кроме антибактериальных свойств также обладает также антивирусным, противораковым и иммунорегуляторным действием [3,4]. Кроме того, совсем недавно было обнаружено, что бактериолитическая активность лизоцима может существенно усиливаться (до 8-10 раз!!!) в отношении ряда бактерий в присутствии смесей заряженных аминокислот и глицина [5,6]. Также на активность лизоцима влияет присутствие некоторых поверхностно активных веществ, которые могут входить в состав некоторых пищевых продуктов [7]. Ещё один важный белок молока, который потенциально проявляет прямую бактериолитическую активность по отношению к некоторым бактериям, - это лактоферрин [8], принадлежащий к семейству белков трансферринов [9]. В данной работе планируется выделение лизоцима и лактоферрина из образцов молока коров чернопестрой голштинизированной породы с последующим исследованием особенностей бактериолитического действия данных белков и влияния низкомолекулярных веществ на их антибактериальную активность с целью создания комплексов безопасных пищевых добавок, которые потенциально могут существенно улучшить полезные свойства молока. Будут разработаны подходы для простого и экспрессного метода оценки количества лизоцима и лактоферрина в молоке для быстрого мониторинга качества молока с использованием простых и безопасных реагентов и простого оборудования. Будут определены основные биохимические и антиоксидантные параметры образцов молока от этих животных, а также корреляции между всеми исследуемыми в работе параметрами. Для лизоцима и лактоферрина будет проведено сравнение субстратной специфичности, определено против каких бактерий эффективнее действует каждый из этих двух белковых факторов. Лизоцим и лактоферрин будут проверены по бактериолитической активности на трёх различных модельных микроорганизмах: Escherichia coli, Micrococcus luteus и Priestia megaterium. Грамотрицательная Escherichia coli - типичный представитель энтеробактерий со строением клетки схожим с Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhi и Yersinia pestis. Грамположительная Micrococcus luteus по строению своей клетки аналог таких потенциально опасных бактерий, как Staphylococcus aureus и Streptococcus pyogenes. Грамположительная спорообразующая палочка Priestia megaterium - модельный организм, отдалённо схожий с Bacillus anthracis. В качестве эффекторов, которые потенциально могут влиять на антибактериальные свойств белков по отношению к разным бактериям будут проверены гистидин, лизин, аргинин, глицин, глутамат, поверхностно активные вещества (ПАВ) Tween 21 и Pluronic P123, природный аналог ПАВ - брюшнотифозный липополисахарид (эндотоксин). Также в работе будет уточнена стабильность лизоцима и лактоферрина при разных режимах кратковременного нагревания. Полученные в работе фундаментальные знания важны для оценки качества молока п возможностей его переработки и создания, в дальнейшем, функциональных молочных продуктов с комплексом V* заданных свойств. Фундаментальные знания о бактериолитических свойствах лизоцима и лактоферрина, полученные в работе, крайне важны для более глубокого понимания роли данных белков в иммунной защите. 1. Chandan R.C., Parry R.M., Shahani K.M. // Biochimica et Biophysica Acta, 1965, V. 110(2), P. 389-398. 2. Levashov P.A., Sedov S.A., Shipovskov S., Belogurova N.G., Levashov A.V.// Anal. Chem., 2010, Vol. 82(5), P. 2161-2163. 3. Ragland S.A., Criss A.K. // PLoS Pathog, 2017, Vol.13(9), e1006512. 4. Steinrauf L.K., Shiuan D., Yang W.J., Chiang M.Y. // Biochem Biophys Res Commun. 1999, Vol. 266(2), P. 366-370. 5. Levashov P.A., Matolygina D.A., Ovchinnikova E.D., Adamova I.Y., Gasanova D.A., Smirnov S.A., Nelyub V.A., Belogurova N.G., Tishkov V.I., Eremeev N.L., Levashov A.V. // FEBS Open Bio, 2019, Vol. 9, P. 510-518. 6. Rastriga N.V., Klimov D.A., Gasanova D.A., Levashov P.A. // Process Biochemistry, 2023, V.125, P. 190-197. 7. Lu W.-J., Smirnov S.A., Levashov P.A. // Biochemical and Biophysical Research Communications, 2021, V. 575, P. 73-77. 8. Ellison R.T., Giehl T.J. // J Clin Invest, 1991, Vol. 88(4), P. 1080-1091. 9. Levashov P., Matolygina D., Ovchinnikova E., Ushakova D., Burmakin V, Cherdyntseva T., Eremeev N., Tishkov V., Levashov A. // FEBS open bio, 2019, V. 9(S1), P. 72-72.

Milk (both human and other mammals) contains lysozyme, which can destroy the cells of various bacteria, i.e. is “non-specific antimicrobial factors of milk”. Lysozyme, as the main bacteriolytic enzyme of the body, has been studied for a very long time, but in recent years, completely new information has appeared both about different isoforms of lysozyme (for example, four types of lysozymes were found in cow's milk) and that this protein also has antiviral, anticancer and immunoregulatory effects. It has also recently been discovered that the activity of lysozyme can be significantly enhanced (up to 8-10 times) against a number of bacteria in the presence of mixtures of charged amino acids and glycine. The activity of lysozyme is also affected by the presence of certain surfactants, analogues of which may be included in food products. Another very important milk protein that can potentially exhibit direct bacteriolytic activity against various bacteria is lactoferrin. In this work, it is planned to isolate lysozyme and lactoferrin from milk samples of black-and-white Holstein cows, followed by a study of the characteristics of the bacteriolytic action of these proteins and the influence of low molecular weight substances on their antibacterial activity in comparison with the corresponding activity of raw cow milk. Approaches will be developed for a simple and rapid method for assessing the amount of these proteins in milk for rapid monitoring of milk quality using simple and safe reagents and simple equipment. The main biochemical and antioxidant parameters of milk samples from these animals will be determined, as well as the correlations between all the above parameters. Lysozyme and lactoferrin will be tested for bacteriolytic activity on three different model microorganisms: Escherichia coli, Micrococcus luteus and Priestia megaterium. Histidine, lysine, arginine, glycine, glutamate, surfactants (surfactants) Tween-21 and Pluronic-P123, and a natural analogue of surfactants - typhoid lipopolysaccharide ( endotoxin). Fundamental knowledge about the bacteriolytic properties of lysozyme and lactoferrin in cow milk, which will be obtained in the work, is extremely important for a deeper understanding of the role of these proteins in the immune defense of animals. The fundamental knowledge obtained in the work is important for assessing the quality of milk, the possibilities of its processing and creation, in the future, of functional dairy products with a set of specified properties.

Ожидаемые результаты о бактериолитических свойствах молока коров (прежде всего таких его компонентов как лизоцим и лактоферрин), которые будут получены в работе, крайне важны как в фундаментальных аспектах (для более глубокого понимания роли данных белков в иммунной защите организма животных), так и в практических аспектах (для оценки качества молока, возможностей его переработки и создания, в дальнейшем - функциональных молочных продуктов с комплексом заданных свойств). Конкретно, будет разработана и оптимизирована методика для экспрессной оценки содержания лизоцима и лактоферрина в молоке; будут получены новые фундаментальные данные о бактериолитических характеристиках лизоцима и лактоферрина по отношению к разным бактериям; будут определены добавки, которые усилят антимикробные свойства молока и позволят создавать более полезные молочные продукты с улучшенными характеристиками.

Опыт разработки методов количественного измерения бактериолитической активности в различных системах. Levashov P.A., Sedov S.A., Shipovskov S., Belogurova N.G., Levashov A.V., Quantitative Turbidimetric Assay of Enzymatic Gram-Negative Bacteria Lysis // Anal. Chem., 2010, Vol. 82(5), P. 2161–2163. https://doi.org/10.1021/ac902978u (Impact Factor: 7.4, Q1) Опыт изучения влияния биологически активных и поверхностно активных веществ на ферментативный лизис живых бактерий. Rastriga N.V., Klimov D.A., Gasanova D.A., Levashov P.A., Comparison of the individual and combined actions of charged amino acids and glycine on the lysis of Escherichia coli cells by human and chicken lysozyme // Process Biochemistry, 2023, V.125, P. 190-197. https://doi.org/10.1016/j.procbio.2022.12.024 Lu W.-J., Smirnov S.A., Levashov P.A., General characteristics of the influence of surfactants on the bacteriolytic activity of lysozyme based on the example of enzymatic lysis of Lactobacillus plantarum cells in the presence of Tween 21 and SDS // Biochemical and Biophysical Research Communications, 2021, V. 575, P. 73-77. http://dx.doi.org/10.1016/j.bbrc.2021.08.060 Опыт обнаружения прямой бактериолитической активности по отношению к разным бактериям у трансферринов. Выделение и идентификация бактериолитических факторов. Levashov P., Matolygina D., Ovchinnikova E., Ushakova D., Burmakin V, Cherdyntseva T., Eremeev N., Tishkov V., Levashov A., Bacteriolytic activity of human blood plasma serotransferrin // FEBS open bio, 2019, V. 9(S1), P. 72-72. http://dx.doi.org/10.1002/2211-5463.12675

Бактериолитическая активность натурального молока определяется несколькими растворимыми в сыворотке (плазме молока) белковыми факторами. Это в первую очередь разные формы лизоцима и лактоферрин. Для оценки соотношения различных факторов был применён метод раздельного измерения активности на трёх разных бактериальных субстратах Micrococcus luteus, Escherichia coli и Priestia megaterium. Такой выбор модельных субстратов обусловлен тем, что это бактерии разных семейств, по отношению к которым разные лизоцимы и лактоферрин могут проявлять различную активность. Micrococcus luteus - типичные грамположительные кокки семейства Микрококков, способные объединяться в сборки по несколько бактерий, часто обитают на коже и слизистых человека. Escherichia coli (кишечная палочка) грамотрицательная палочковидная бактерия, обитающая в норме в кишечнике человека, типичный представитель семейства Энтеробактерий, родственный микроорганизмам Сальмонеллам и Шигеллам. Priestia megaterium (капустная палочка) - грамположительная спорообразующая бактерия семейства Бацилл, непатогенный аналог Bacillus anthracis возбудителя сибирской язвы. Образцы молока разных коров (чёрно-пёстрая голштинская порода) хранились при -20 °C. При пробоподготовке проводили центрифугирование 13000 об/мин (11 500 g) в течение 10 минут. При неполном разделении образцов центрифугирование проводили дважды. После разделения жировая часть (сверху пробирки) удалялась из молока, фракция растворимых белков (средняя часть без осадка соматических клеток и агрегатов нерастворимых белков). Фракция растворимых белков дополнительно фильтровалась через микробиальные нейлоновые фильтры с порами 0.4 мкм и 0.2 мкм. Препараты были разлиты в пробирки по 200 мкл и заморожены на -70 °С. Для культивирования P. megaterium применяли питательную среду LB (Бактотриптон 10 г/л, Дрожжевой экстракт 5 г/л , NaCl 5 г/л), pH 7,6, с добавлением неорганических солей: на 1 л среды 1 мг FeSO4·7H2O, 1,2 мг MnCl2·4H2O, 1,6 мг MgSO4·7H2O. Культивирование проводили в два этапа: на первом этапе (получение ночной культуры) в пробирку с 5 мл среды добавляли 200 мкл музейной культуры и инкубировали при температуре 37 °С в течение 20 часов. Для второго этапа в конические колбы со 100 мл среды добавляли по 1 мл ночной культуры и затем при аэрации, при температуре 37 °С инкубировали до получения оптического поглощения 1,0 при длине волны 630 нм (этап продолжался 8 часов). Полученную культуру клеток P. megaterium центрифугировали при температуре 4 °С при 6000 об/мин 30 мин в пробирках объёмом 50 мл. Осадок клеток суспендировали в буферном растворе: 0,01М трис-MES-ацетат, 50 мМ NaCl, pH 7,5 (7 мл на одну пробирку с осадком). Аликвоты полученной суспензии по 1 мл хранили при температуре –70°С. Для культивирования E.coli и M.luteus применяли питательную среду LB (Бактотриптон 10 г/л, Дрожжевой экстракт 5 г/л, NaCl 5 г/л) pH 7,6. Культивирование проводили в два этапа: на первом этапе (получение ночной культуры) в пробирку с 5 мл среды добавляли 200 мкл музейной культуры и инкубировали при температуре 37 °С в течение 20 часов. Для второго этапа в конические колбы со 100 мл среды добавляли по 1 мл ночной культуры и затем при аэрации, при температуре 37°С инкубировали до получения оптического поглощения 1,0 при длине волны 630 нм (этап продолжался 8 часов). Полученную культуру клеток E. coli и M. luteus центрифугировали при температуре 4°С при 6000 об/мин 30 мин в пробирках объёмом 50 мл. Осадок клеток суспендировали в буферном растворе: 0,01 М трис-MES-ацетат, 50 мМ NaCl, pH7,5 (7 мл на одну пробирку с осадком). Аликвоты полученной суспензии по 1 мл хранили при температуре –70°С. Проводился скрининг бактериолитической активности на трёх бактериальных субстратах: M. luteus, E. сoli и P. megaterium. Активности рассчитывали с учётом разведения в «условных единицах» концентрации лизоцима на основании градировочных кривых по куриному яичному лизоциму. Определение активного лизоцима турбидиметрическим методом. Для определения активного лизоцима использовалась методика с измерением бактериолитической активности фермента и сопоставлением с калибровочной зависимостью для стандартного очищенного фермента. Суспензию клеток бактерий готовили непосредственно перед измерениями. Измерения производили в буферном растворе: 0,02 М трис, pH 8,5, с добавлением 40 мМ NaCl. Препарат клеток суспендировали в буферном растворе и центрифугировали на при 3500 об/мин в течение 5 мин. Затем супернатант удаляли и суспендировали осадок в 4—5 мл того же буферного раствора. В качестве стандартного раствора фермента использовали раствор куриного яичного лизоцима в концентрации 1-10 мкг/мл. Оптическое поглощение реакционной среды регистрировали при длине волны 630 нм при температуре 25°С. Раствор белка необходимой концентрации (стандарт или образец) объёмом 200 мкл на лунку планшета термостатировали в течение 3 мин, затем добавляли 30-100 мкл суспензии клеток, что бы получить в итоге поглощение реакционной среды в лунке 0,28—0,32, и регистрировали поглощение каждые 30 с в течение 7 мин. Калибровочная зависимость скорости лизиса клеток от массы лизоцима в пробе (лунке) приведена на рис. 2. Суммарный объём раствора в лунке 250 мкл. По результатам измерения, разные образцы молока разных коров очень сильно отличаются по содержанию антибактериальных факторов. Это в целом согласуется с литературными данными, которые были получены только для одного субстрата M. luteus. Также обнаружены разные типы молока: 1). Не имеющие активности на спорообразующих бациллах; 2). Не имеющие активности против кишечной палочки; 3) имеющие очень высокий уровень активности против спорообразующих бацилл; 4) имеющие равномерное распределение активностей против разных бактерий. Таким образом на данном этапе работы можно сделать следующие выводы: 1. Подобраны условия для пробоподготовки образцов молока и измерения бактериолитической активности препаратов на трёх разных субстратах - живых бактериальных клетках (Escherichia coli, Micrococcus luteus и Priestia megaterium). 2. Результаты измерений воспроизводимы. 3. Метод измерения на 3 разных субстрата позволяет выявить несколько разных типов молока с кардинально различными антибактериальными свойствами. Были проанализированы 50 образцов молока здоровых коров черно-пёстрой породы из хозяйств средней полосы и юга Российской Федерации. Надо отметить, что по общему белку разное молоко (молочная сыворотка) имеет близкие показатели, то есть это нормальные относительно стандартные образцы материала. Однако, как видим по результатам измерения, разные образцы молока разных коров очень сильно отличаются по содержанию антибактериальных факторов. В некоторых образцах молока вообще не было обнаружено активности. Это в целом согласуется с литературными данными, которые были получены только для одного субстрата M. luteus. Также обнаружены разные типы молока: 1) Не имеющие активности на спорообразующих бациллах; 2) Не имеющие активности против кишечной палочки; 3) имеющие очень высокий уровень активности против спорообразующих бацилл; 4) имеющие равномерное распределение активностей против разных бактерий. Далее для сравнения мы оставили только те образцы, в которых бактериолитическая активность существенно отличается от нулевой. Отметим образцы наиболее активные на M. luteus (истинная муромидазная активность характерная для лизоцимов, показатель уровня именно лизоцима, а не лактоферрина, который неактивен на M. luteus). При этом в некоторых образцах условно лактоферриновая активность в 10 и 2 раза превышает лизоцимную, также видим близкий уровень активности на Escherichia coli и P.megaterium, что свидетельствует в пользу того, что кроме лизоцима и лактоферрина в этом молоке практически нет других бактериолитических факторов с иной специфичностью. Отдельные образцы имеют активность на M. luteus, значительно превышающую активность на Escherichia coli, предположительно содержат лизоцим не типа С (как в большинстве образцов), а типа G, который менее эффективен для лизиса Escherichia coli. Также имеются образцы, у которых намного выше активность на спорообразующих бациллах (P. megaterium) по сравнению с активностью на M. luteus и Escherichia coli, возможно это образцы с высоким содержанием катионных пептидов -дефензинов. В работе получены результаты проверки сохранения активности при хранении образцов в разных условиях (измерялась активность на Микрококке). В течение 2 месяцев практически не изменяется активность при хранении при температуре -20°С. При температуре -5°С наблюдается некоторое снижение активности за 2 месяца, но инактивация не превышает 50%. За 15 дней при хранении при температуре +5°С активность снижается в присутствии консерванта (ЭДТА) в 2-5 раз, без консерванта в 5-10 раз. Таким образом на данном этапе работы можно сделать следующие выводы: 1. Проанализировано 50 образцов молока здоровых коров чёрно пёстрой породы на наличие бактериолитической активности против 3 разных бактерий: на Escherichia coli, Micrococcus luteus и Priestia megaterium. Получены результаты (в условных единицах мкг/л лизоцима): на Escherichia coli 0-10918, Micrococcus luteus 0-1590, на Priestia megaterium 0-14033. 2. Показано, что для сохранения показателей бактериолитической активности в препаратах в течение 2 месяцев необходимо хранение при температуре не менее -20 °С. В настоящий момент в литературе полностью отсутствуют сведения о прямой бактериолитической активности лактоферрина (функции разрушения бактерий подобно лизоциму), есть информация лишь о бактериостатической и бактерицидной функции (гибель клеток без немедленного разрушения) [Klimov, D.A., Levashov, P.A. Structural Features and Properties of Transferrins: A Review. Appl Biochem Microbiol 61, 1003–1033 (2025). https://doi.org/10.1134/S0003683825600903]. Мы в своей работе, имея предварительные положительные экспериментальные результаты, исследовали этот момент более системно. В данном разделе приводим результаты по исследованию бактериолитической активности высокоочищенного лактоферрина коров (Bovine Lactoferrin L9507 (Sigma-Aldrich, США). Активность у данного препарата имеется только против Escherichia coli. На клетки Micrococcus luteus данный препарат лактоферрина не действует. В работе получена трёхмерная зависимость бактериолитической активности (против E. coli) лактоферрина коров от ионной силы раствора и рН. Как мы видим, у лактоферрина имеется чёткий рН оптимум активности. Картина в целом несколько похожа на аналогичные зависимости для лизоцимов из разных источников [Nikolay V. Rastriga, Dmitry A. Klimov, Dariya A. Gasanova, Pavel A. Levashov, Comparison of the individual and combined actions of charged amino acids and glycine on the lysis of Escherichia coli cells by human and chicken lysozyme, Process Biochemistry, Volume 125, 2023, Pages 190-197,https://doi.org/10.1016/j.procbio.2022.12.024. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1359511322004640]. Наличие чёткого рН оптимумам зависимости бактериолитической активности лактоферрина может свидетельствовать о наличии у данного белка свойств фермента, что ранее не исследовалось и не описано в научной литературе. Лизоцим в отличие от лактоферрина активен против Micrococcus luteus [Levashov, P.A., Matolygina, D.A., Ovchinnikova, E.D., Adamova, I.Y., Gasanova, D.A., Smirnov, S.A., Nelyub, V.A., Belogurova, N.G., Tishkov, V.I., Eremeev, N.L. and Levashov, A.V. (2019), The bacteriolytic activity of native and covalently immobilized lysozyme against Gram-positive and Gram-negative bacteria is differentially affected by charged amino acids and glycine. FEBS Open Bio, 9: 510-518. https://doi.org/10.1002/2211-5463.12591] Очищенный лактоферрин был проверен в условиях оптимума активности ( против E. coli) на влияние активирующей добавки (5 мМ лизина, 5мМ гистидин, 5 мМ глутамат, 5 мМ аргинин, 1 мМ глицин). Усиление активности составило 1.6 раза. Зависимость активности лактоферрина от количества добавленной смеси активаторов приблизительно линейная в диапазоне 2-10 мМ концентрации каждой из аминокислот. Также было проверено активирующее действие поверхностно активных веществ Плюроник Р123 и Твин 21. В отличие от монотонной активации (против E. coli) лактоферрина смесью аминокислот при влиянии ПАВ (поверхностно активных веществ) мы имеем зависимости с максимумами. Наиболее заметный активирующий эффект (приблизительно в 2 раза усиление активности) дают концентрации ПАВ 2 мкМ. Проведено хроматографическое разделение бактериолитических факторов молока. По хроматограммам видим, что только лизоцим активен против Micrococcus luteus. И лизоцим и лактоферрин активны на E. coli. Степени усиления активности против E. coli для фракции лизоцима коровы для смеси аминокислот (5 мМ лизина, 5мМ гистидин, 5 мМ глутамат, 5 мМ аргинин, 1 мМ глицин) составила 1.6 раз, для Плюроника Р123 в концентрации 02 мкМ и Твина 21 в концентрации 02 мкМ усиление активности составило до 2 раз . Проведено сравнение данных по антиоксидантной активности (АОА), бактериолитической активности, суточного удоя, лактоферрина. Антиоксидантная активность исследована методом Зайцева [Zaitsev, Sergei Yu., Voronina, Oksana A., Savina, Anastasia A., Ignatieva, Larisa P., Bogolyubova, Nadezhda V., Correlations between the Total Antioxidant Activity and Biochemical Parameters of Cow Milk Depending on the Number of Somatic Cells, International Journal of Food Science, 2022, 5323621, 6 pages, 2022. https://doi.org/10.1155/2022/5323621]. Коровий лактоферрин измерен иммуноферментным анализом набором USEA063-Bo https://uscn.ru/. Общая антиоксидантная активность не коррелирует ни с антимикробной активностью ни с содержанием лактоферрина. По сочетанию содержания лактоферрина и антимикробной бактериолитической активностью можно сказать, что есть несколько понятных легко объяснимых сочетаний. Выделено рыжим, где «лактоферриновая» активность (против E.coli) заметно превышает «лизоцимную» (против M. luteus) и при этом логично имеется высокая концентрация лактоферрина. Есть «аномальные» варианты препаратов молока, где лактоферрина очень много, но он неактивен (либо это такая особая форма лактоферрина у данных коров, либо он чем-то ингибирован). Ещё есть образцы с «аномально высокой» бактериолитической активностью против P.megaterium, которая не коррелирует ни с содержанием лизоцима, ни с содержанием лактоферрина. Возможно, что это образцы с низкомолекулярными дефензинами, которые не выявились при хроматографическом разделении белков, так как в виду небольшого размера лежат вне диапазона фракционирования молекулярных масс выбранной колонкой. Данные образцы требуют особого внимания и дальнейшего изучения. Пируват является одним из антиоксидантных параметров, также он может выступать маркером бактериальной обсеменённости. Обнаружено, что самая низкая обсеменённость соответствует наибольшей бактериолитической активности и наибольшему содержанию лактоферрина. Данный феномен вероятно нужно более подробно изучить в дальнейшем. Также было обнаружено, что иммуноферментный набор на коровий лактоферрин также выявляет лактоферрин в молоке коз. Значения при этом некорректные, так как нужен стандарт козьего лактоферрина, но сам факт вероятного совпадения эпитопов для узнавания антител и возможности использования набора для определения лактоферрина козы может быть полезен.