ИСТИНА

Диаденозиновые полифосфаты представляют собой группу или класс молекул, в структуру которых входят два аденозиновых основания, соединенных несколькими остатками фосфорной кислоты (и имеют аббревиатуру АpnA), и таким образом, являются производными пуриновых нуклеотидов. Диаденозиновые полифосфаты являются эндогенными соединениями: они образуются при помощи специфических ферментных систем в большинстве тканей организма, они присутствуют в цитоплазме, во внеклеточной середе и плазме крови (Baxi MD, Vishwanatha JK. J Pharmacol Toxicol. Methods 1995;33:121–128). В настоящее время показано, что диаденозиновые полифосфаты их производные являются новым классом регуляторных соединений, паракринных факторов, обладающих широким спектром физиологической активности. Некоторые диаденозиновые полифосфаты выделяются совместно с классическими нейромедиаторами (норадреналином) в составе синаптических везикул, т.е. являются комедиаторами (Flores NA1, Stavrou BM, Sheridan DJ. Cardiovasc Res. 1999 Apr;42(1):15-26.). Показано, что ряд диаденозиновых полифосфатов самостоятельно способен регулировать кровоток и тонус гладкой мускулатуры сосудов, полых органов, агрегацию тромбоцитов, клеточную пролиферацию (Flores NA1, Stavrou BM, Sheridan DJ. Cardiovasc Res. 1999 Apr;42(1):15-26.). Действие диаденозиновых полифосфатов частично связывают с активацией P2Y и Р2Х пуриновых рецепторов (Hoyle CH1, Ziganshin AU, Pintor J, Burnstock G., Br J Pharmacol. 1996 Jul;118(5):1294-300), показано прямое их действие на ионные каналы. Однако, полностью рецепторные, внутриклеточные и ионные механизмы действия диаденозиновых соединений в различных типах тканей не установлены. Предполагается, что диаденозиновые полифосфаты, имеющие разную длину цепи остатков фосфорной кислоты (от 1 - АpA, до 6 – Аp6A) обладают различной биологической активностью и рецепторными механизмами действия. Наибольший интерес, как регуляторные соединения, обладающие потенциальной практической и/или фармакологической значимостью, вероятно представляют диаденозин тетра- и пентафосфат. Физиологической активностью также обладают специфические метаболиты (например АДФ-рибоза), а также соединения, сходные по структуре с диаденозиновыми полифосфатами, например, молекулы, в которых замещен один из остатков аденозина. Наиболее известным примером, является никотинамидаденидинуклеотид (НАД+). Внеклеточный или экзогенный НАД+ в настоящее время рассматривается, как новый, полноценный нейромедиатор (Bobalova and Mutafova-Yambolieva, 2006; Durnin L, Sanders KM, Mutafova-Yambolieva VN. Neurogastroenterol Motil. 2013 Mar;25(3):e194-204., Mutafova-Yambolieva VN. IUBMB Life. 2012 Oct;64(10):817-24). Физиологическая активность НАД+ как нейромедиатора малоизученна, но механизмы его действия связывают с пуринорецепторами. Диаденозиновые полифосфаты вероятно играют важную регуляторную роль как в норме, так и при патологии. Показано, что уровень диаденозиновых полифосфатов существенно увеличивается в ткани сердца при ишемическом повреждении и гибели кардиомиоцитов. Большое количество различных подтипов пуриновых рецепторов, вероятно, являющихся мишенью для диаденозиновых полифосфатов и НАД+, имеется на мембране кардиомиоцитов. Тем не менее, практически полностью отсутствуют сведения о влиянии и механизмах действия диаденозиновых полифосфатов на рабочий миокард сердца, проводящую систему сердца, сведения об участии в симпатическом и парасимпатическом контроле работы сердца. Среди диаденозиновых полифосфатов могут присутствовать соединения, оказывающие существенное влияние на сократимость кардиомиоцитов, влияющие на выживание кардиомиоцитов в условиях ишемии, оказывающие действие на ионные токи кардиомиоцитов, и, соответственно, распространение возбуждения в сердечной ткани. Диаденозиновые полифосфаты привлекают в настоящее время внимание, как важный фактор, определяющий изменение сократительной активности, формирование нарушений ритма при повреждении миокарда или нарушении нервной регуляции сердца. Реализация проекта позволит определить возможность практического применения новых эндогенных регуляторов работы сердца при коррекции ишемического повреждения миокарда, коррекции биоэлектрической активности, способствующей возникновению нарушений ритма сердца. В связи с вышесказанным, цель настоящего проекта заключается в выявлении эффектов и изучении механизмов действия определенных диаденозиновых полифосфатов (Аp4A, Аp5A) и их производных (НАД+) на биоэлектрическую и сократительную активность сердца, нервный контроль работы сердца. Ранее подобных исследований не проводилось.

Diadenosine polyphosphates are the group or class of molecules, which contain two adenosine bases linked by several residues of phosphorous acid (and are usually abbreviated as ApnA) and therefore belong to the derivates of purine nucleotides. Diadenosine polyphosphates are endogenous compounds: they can be synthesized by specific enzyme systems in various tissues; they are present in cytoplasm, extracellular medium and even in the blood plasma (Baxi MD, Vishwanatha JK. J Pharmacol Toxicol. Methods 1995;33:121–128.). It has been recently understood that diadenosine polyphosphates and their derivatives represent a new class of paracrine regulatory compounds with wide range of physiological activity. Some diadenosine nucleotides are excreted together with classic neurotransmitters (noradrenaline) via synaptic vesicles and therefore may be concerned as comediators (Flores NA1, Stavrou BM, Sheridan DJ. Cardiovasc Res. 1999 Apr;42(1):15-26.). It is demonstrated that diadenosine polyphosphates can modulate blood flow and smooth muscle tone in blood vessels and hollow organs as well as platelets aggregation and cell proliferation (Flores NA1, Stavrou BM, Sheridan DJ. Cardiovasc Res. 1999 Apr;42(1):15-26.). The effects of diadenosine polyphosphates are partially mediated by P2Y and P2X purinoreceptors (Hoyle CH1, Ziganshin AU, Pintor J, Burnstock G., Br J Pharmacol. 1996 Jul;118(5):1294-300). In addition, these compounds can directly bind with ion channels and modulate their function. However, receptor-mediated and intracellular mechanisms of diadenosine polyphosphates effects are elucidated not completely. It is hypothesized that biological activity and receptor-mediated mechanism of action may depend on the length of the chain consisting of phosphorous acid residues. Diadenosine tetra- and pentaphosphate seem to be the most interesting as regulatory compounds with potential practical and pharmacological implications. Specific metabolites of diadenosine polyphosphates (ADP-ribose) and compounds with a structure close to these compounds also demonstrate significant physiological activity. For example, in the molecule of nicotinamide-adenine dinucleotide (NAD+) one of adenosine residues is substituted. Extracellular NAD+ is now considered as a new neurotransmitter (Bobalova and Mutafova-Yambolieva, 2006; Durnin L, Sanders KM, Mutafova-Yambolieva VN. Neurogastroenterol Motil. 2013 Mar;25(3):e194-204., Mutafova-Yambolieva VN. IUBMB Life. 2012 Oct;64(10):817-24). Physiological activity of NAD+ is weakly studied, but mechanisms of its effects are attributed to purinoreceptors. Diadenosine polyphosphates play probably important role both in normal and pathological conditions. It is shown that diadenosine polyphosphates content in myocardium is considerably increased during the ischemia and consequent death of cardiomyocytes. Cardiomyocytes widely express various subtypes of purinoreceptors, which probably mediate effects of diadenosine polyphosphates and NAD+. Nevertheless, to our knowledge there is no available information about effects of diadenosine polyphosphates on the working myocardium, cardiac conductive system and their role in sympathetic and parasympathetic control of cardiac performance. It may be hypothesized that some of the diadenosine polyphosphates affect contractility of the cardiomyocytes, survival rate of cardiomyocytes under ischemia and also modulate cardiac ionic currents, therefore leading to alteration of excitation propagation pattern in myocardium. Diadenosine polyphosphates deserve attention as an important factor, which determines changes in contractile activity and susceptibility to arrhythmias in case of myocardial injury or disfunction of nervous regulation of the heart. Thus, the aim of the present project is to elucidate effects of some diadenosine polyphosphates (Ap4A, Ap5A) and their derivatives (NAD+) on bioelectrical and contractile activity of myocardium, nervous control of cardiac function and to uncover the mechanisms of these putative effects. Such complex investigation is unique and has no analogues.

Было проведено комплексное исследование воздействия новой группы пуриновых кардиорегуляторов, диаденозиновых полифосфатов и НАД+, на электрическую и сократительную активность миокарда млекопитающих, а также раскрыты молекулярные механизмы кардиотропных эффектов этих соединений. Исследование проводилось на органном, тканевом, клеточном и молекулярном уровне организации с использованием целого комплекса современных физиологических и молекулярно-биологических методов. В экспериментах на изолированных сердцах крысы, ретроградно перфузируемых по Лангендорфу было выяснено, что диаденозин пентафосфат (Ар5А), диаденозин тетрафосфат (Ар4А) и НАД+ (0,1 – 10 мкМ) существенно модифицируют сократительную активность желудочкового миокарда, вызывая в первую очередь снижение сократимости и увеличение скорости расслабления. Выраженность этих эффектов для 3 исследованных соединений изменяется в последовательности: НАД+<Ap4A<Ap5A. Кроме того, все 3 соединения в концентрации 10 мкМ замедляют проведение возбуждения в атриовентрикулярном соединении, но не влияют на проведение в рабочем миокарде желудочков. Эксперименты на тканевых препаратах миокарда с использованием метода внутриклеточной регистрации электрической активности стеклянными микроэлектродами показали, что основное действие Ар5А, Ар4А и НАД+ (10 мкМ) на конфигурацию электрической активности в рабочем миокарде предсердий и желудочков крысы заключается в уменьшении длительности ПД («отрицательный» эффект). Среди изученных типов миокарда данный эффект наиболее сильно проявляется в стенке правого желудочка, а наименее сильно – в межпредсердной перегородке. НАД+, в отличие от Ар5А и Ар4А, вызывает также кратковременное увеличение длительности ПД («положительный» эффект), предшествующее укорочению. В миокардиальных рукавах легочных вен крысы 10 мкМ Ар5А, Ар4А и НАД+(в меньшей степени) вызывали проаритмические изменения электрической активности: укорочение ПД и усиление спонтанной активности, индуцированной норадреналином. Все 3 соединения (10-100 мкМ) уменьшают длительность ПД, а также тормозят автоматическую активность в волокнах Пуркинье (пейсмекере сердца млекопитающих третьего порядка). Также Ар5А, Ар4А и НАД+ в концентрации 100 мкМ подавляют автоматию и в синоатриальном узле млекопитающих (пейсмекере первого порядка). В экспериментах на препаратах предсердного миокарда крысы с использованием селективных антагонистов различных типов пуринорецепторов было выяснено, что электрофизиологические эффекты диаденозиновых полифосфатов и НАД+ реализуются главным образом через Р2-пуринорецепторы. При этом за транзиторный «положительный» эффект НАД+ отвечают ионотропные рецепторы подтипа Р2Х7, которые экспрессируются как в предсердном, так и в желудочковом миокарде. За основной, «отрицательный» эффект отвечают метаботропные Р2Y-рецепторы, по меньшей мере подтипа P2Y1, экспрессия гена которых также была показана в предсердном и в желудочковом миокарде методом РВ-ПЦР. Молекулярный механизм этого эффекта включает активацию Gq-белков и, как следствие, фосфоинозитольного каскада внутриклеточной сигнализации, приводящую в итоге по меньшей мере к уменьшению кальциевого тока L-типа (ICaL), следствием которого является уменьшение длительности ПД. В отличие от крысы, в сердце морской свинки выраженные эффекты Ар5А, Ар4А и НАД+ достигаются только при использовании большей концентрации (100 мкМ), чем в миокарде крысы, и реализуются через иной тип рецепторов – Р1. Молекулярный механизм заключается в активации сопряженных с Р1-рецепторами Gi-белков и открытии калиевых ацетилхолинзависимых каналов, переносящих ток IKACh. За счет активации данного тока развивается уменьшение длительности ПД в предсердном миокарде, а в клетках синоатриального узла также гиперполяризация и замедление автоматической активности. Помимо всех перечисленных выше эффектов, обусловленных прямым действием Ар5А, Ар4А и НАД+ на кардиомиоциты, важную роль в регуляции этими соединениями сердечной деятельности может играть их способность ослаблять симпатические воздействия. Такая способность была нами показана для Ар5А и Ар4А на примере симпатической регуляции синоатриального узла кролика. При этом на холинергические эффекты в синоатриальном узле ни одно из трех соединений не влияет.