ИСТИНА

Проект посвящен разработке новых экологически безопасных средств защиты с/х продукции от насекомых-вредителей на основе комбинации различных по механизму действия компонентов. Мы предлагаем два подхода к решению этой задачи: поиск более активных аналогов известных препаратов и разработку новых эффективных комбинаций из природных инсектицидов с различным механизмом действия. Объектами наших совместных исследований являются три вида жуков: Callosobruchus maculatus (Coleoptera: Bruchidae) – серьезный вредитель бобовых культур как на полях, так и на складах, и два вредителя запасов зерновых культур и продуктов их переработки из семейства Tenebrionidae –Tribolium castaneum, для которого впервые среди жуков был полностью расшифрован геном и Tenebrio molitor, который является модельным организмом для биохимических исследований. Главные пищеварительные ферменты этих жуков – это цистеиновые пептидазы (ЦП) и амилазы, мРНК которых относятся к группе наиболее высокоэкспрессируемых в транскриптомах кишечников личинок. В качестве базовых экологически безопасных инсектицидов мы выбрали ингибиторы цистеиновых пептидаз (ИЦП), ингибиторы амилаз (ИА) и энтомоцидный токсин Bacillus thuringiensis Cry3Aa, который безопасен для человека, но избирательно действует на личинок жуков. Египетские заявители проведут поиск эффективных ИЦП и ИА в семенах высших растений Египта, которые оказались устойчивыми к атаке насекомых-вредителей. Российские ученые проведут очистку накопительных препаратов ИЦП (полученных египетской стороной), а также пищеварительных ЦП насекомых и получат рекомбинантные препараты наиболее важных ЦП, после чего протестируют активность ИЦП in vitro на всех препаратах ЦП, а эффективность ИА будет протестирована на частично очищенных препаратах кишечных амилаз египетскими заявителями. Токсин Cry3Aa B. thuringiensis – самый эффективный по отношению к представителям отряда жуков. Этот токсин активен против личинок C. maculatus и T. molitor, однако его действие не приводит к быстрой и высокой смертности этих насекомых, и он практически не действует на личинок T. castaneum. Мы предполагаем, что ограниченность действия токсина связана с тем, что пищеварительные ЦП исследуемых жуков обладают широкой субстратной специфичностью, и это позволяет им гидролизовать устойчивые к деградации под действием сериновых пептидаз токсины B. thuringiensis, что показано в наших предварительных исследованиях. В таком случае эффективные ИЦП будут предотвращать гидролиз токсина Cry3Aa и повышать его токсический эффект, а добавление в диету насекомых природного ИА позволит снизить компенсационный эффект и, соответственно, жизнеспособность этих насекомых. Египетские заявители протестируют in vivo действие наиболее активных ИЦП, ИА, а также токсина Cry3Aa по отдельности и в разных комбинациях на личинок каждого из трех модельных насекомых, в результате чего будут выбраны смеси с наиболее эффективными соотношениями компонентов для каждого вида насекомых. Предложенные новые смеси можно будет применять как в виде белковых препаратов, так и использовать для получения трансгенных линий растений, устойчивых к насекомым-вредителям.

The project is devoted to the development of new environmentally friendly means of protection of agricultural products from insect pests on the basis of a combination of different components of the mechanism of action. We offer two approaches to solving this problem: searching for more active analogues of known drugs and developing new effective combinations of natural insecticides with different mechanisms of action. The objects of our joint research are three species of beetles: Callosobruchus maculatus (Coleoptera: Bruchidae) - a serious pest of leguminous crops both in fields and warehouses, and two pests of cereals and their products from the family Tenebrionidae-Tribolium castaneum, for which the first time among the beetles was completely deciphered by the genome and Tenebrio molitor, which is a model organism for biochemical studies. The main digestive enzymes of these beetles are cysteine ​​peptidases (CP) and amylases, whose mRNAs belong to the group of larvae most highly expressed in the transcripts of intestines. As basic ecologically safe insecticides we have chosen cysteine ​​peptidase (PPI) inhibitors, amylase (IA) inhibitors and Bacillus thuringiensis Cry3Aa entomocidal toxin, which is safe for humans, but selectively acts on larvae of beetles.

1. Получение очищенных препаратов кишечных ЦП из личинок жуков T. castaneum и T. molitor. 2. Получение рекомбинантного препарата наиболее активной пищеварительной ЦП личинок T. castaneum. 3. Исследование влияния суммарного препарата пищеварительных пептидаз личинок T. castaneum на энтомоцидный токсин Cry3Aa Bacillus thuringiensis в опытах in vitro. Оценка вклада главной ЦП в суммарный эффект. 4. Исследование влияния рекомбинантного препарата наиболее активной пищеварительной цистеиновой пептидазы личинок T. castaneum на энтомоцидный токсин Cry3Aa в опытах in vitro. 5. Исследование влияния пищеварительных пептидаз личинок T. molitor на энтомоцидный токсин Cry3Aa в опытах in vitro. 6. Разработка совместно с египетской стороной рекомендаций по использованию токсина Cry3Aa для борьбы с личинками жуков-вредителей.

У российского коллектива заявителей имеется большой опыт работы по изучению пептидаз и их ингибиторов и использованию этих белков для решения научных и прикладных задач. Проводятся также исследования эндотоксинов Bt и их взаимодействия с пищеварительными пептидазами ряда насекомых. Участники проекта в течение многих лет занимаются изучением пептидаз, входящих в состав пищеварительного комплекса насекомых.

1. Получены очищенные препараты кишечных ЦП из личинок жуков T. castaneum и T. molitor. 2. Получены рекомбинантные препараты наиболее активной цистеиновой пищеварительной ЦП личинок T. castaneum и наиболее активной пролинспецифичной пищеварительной ЦП личинок T. molitor. 3. Исследовано влияние суммарного препарата пищеварительных пептидаз личинок T. castaneum на энтомоцидный токсин Cry3Aa Bacillus thuringiensis в опытах in vitro. Показана способность пищеварительных пептидаз к деградации токсина. 4. Исследовано влияния рекомбинантного препарата наиболее активной пищеварительной цистеиновой пептидазы личинок T. castaneum на энтомоцидный токсин Cry3Aa в опытах in vitro. Показана главная роль этой пептидазы в деградации токсина. 5. Исследование влияния пищеварительных пептидаз личинок T. molitor на энтомоцидный токсин Cry3Aa в опытах in vitro. Показано отсутствие способности к деградации токсина пищеварительными пептидазами этого насекомого. 6. Разработаны совместно с египетской стороной рекомендации по использованию ингибиторов пептидаз совместно с токсином Cry3Aa для борьбы с личинками T. castaneum.