ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИСТИНА ПсковГУ |
||
Бактерия Neisseria gonorrhoeae является патогеном человека. Поиск новых мишеней для лекарственных препаратов требует детальных знаний о контактах между биомолекулами, осуществляющихся в процессе функционирования болезнетворной бактерии. Система репарации неканонических пар нуклеотидов или «мисматчей» (MMR) обеспечивает неизменность генетической информации в процессе репликации ДНК во всех организмах. Фундаментальной целью проекта является исследование координации активности белковых компонентов системы MMR при инициации репарации ДНК у прокариот, отличающихся от E. coli. Одной из важнейших задач, на решение которой направлен проект, является установление контактов между белками MutS, MutL, фактором процессивности прокариот – бета-субъединицей ДНК-полимеразы III (бета-«зажимом»), хеликазой UvrD и белком рекомбинации с экзонуклеазной функцией RecJ из N. gonorrhoeae. В качестве основного метода исследования белок-белковых взаимодействий в процессе MMR выбран современный подход, заключающийся в химической «сшивке» биомолекул в сочетании с протеолитическим расщеплением и масс-спектрометрией (XL-MS). Белки системы MMR функционируют на ДНК и характеризуются чрезвычайной конформационной вариабельностью и динамической подвижностью. Поэтому в проекте мы предлагаем усовершенствованный метод XL-MS, в котором ключевые белки системы MMR будут зафиксированы на ДНК. Для получения ковалентно связанного тройного комплекса ДНК с двумя «сшитыми» между собой белками предполагается использовать гетеробифункциональные соединения, содержащие реакционноспособные группы, взаимодействующие с остатками лизина и цистеина. Такие кросслинкеры не применялись ранее в методе XL-MS. Использование различных «сшивающих» агентов даст возможность оценить сближенность белков в составе тройного комплекса и получить информацию о его топологии. Полученная совместно с индийскими партнерами информация будет использована для создания комплексной картины событий, связанных с репарацией «мисматчей» в бактерии N. gonorrhoeae.
The bacterium Neisseria gonorrhoeae is a human pathogen. The search for new targets for drugs requires a detailed knowledge of the contacts between biomolecules occurring in the operation of pathogenic bacteria. Repair system non-canonical base pairs or "mismatch" (MMR) ensures the immutability of genetic information during DNA replication in all organisms. The fundamental aim of the project is to study the coordination of activity of protein components of the MMR system in the initiation of DNA repair in prokaryotes that differ from E. coli. The main method of the study of protein-protein interactions in the MMR process is the modern approach to chemical "crosslinking" of biomolecules in combination with proteolytic digestion and mass spectrometry (XL-MS). Proteins of the MMR system function on DNA conformation and are characterized by extreme variability and dynamic mobility. Therefore, we provide an improved method for XL-MS, in which the key proteins of the MMR system will be recorded in the DNA. To obtain a covalently bound ternary complex of DNA with two "crosslinked" together with proteins is supposed to be used heterobifunctional compounds containing reactive groups that interact with residues of lysine and cysteine. Such crosslinker not been used previously in the method of XL-MS. Obtained together with Indian partners the information will be used to create a comprehensive picture of the events associated with the repair of "mismatches" in the bacteria N. gonorrhoeae.
Получение мутантных форм белков MutS и MutL из системы репарации MMR N. gonorrhoeae с единственным остатком цистеина для фиксации на ДНК. Сравнительный анализ функциональной активности полученных мутантов с белками дикого типа. Проведение аффинной модификации одноцистеиновых мутантных форм MutS и MutL из N. gonorrhoeae с помощью реакционноспособных ДНК, несущих пиридилдисульфидную группировку. Наибольшая скорость реакции в случае одного из моноцистеиновых мутантов будет свидетельствовать о максимальной сближенности реакционноспособной группы в ДНК с данным остатком цистеина, что позволит сделать вывод о возможности использования его при получении тройного ковалентно связанного комплекса. Отработка условий выделения и подтверждения функциональной активности выделенных конъюгатов по их спосбности гидролизовать АТФ. Дизайн и синтез не используемых ранее для получения белок-белковых конъюгатов гетерофункциональных соединений, содержащих функциональные группы, взаимодействующие с остатками лизина и цистеина белка, а также третью функцию - флуоресцентную метку или молекулу биотина. Отработка условий модификации конъюгата ДНК-MutS или ДНК-MutL по остаткам лизина как коммерческими гетеробифункциональными кросслинкерами, так и предложенными в данной работе, в состав которых входят малеимидная и N-гидроксисукцинимидная группировки. Получение ковалентно связанных тройных комплексов ДНК с двумя белками в количествах, достаточных для последующих исследований, отработка условий протеолиза комплексов и масс-спектрометрического анализа полученных пептидов. Выявление белок-белковых контактов, возникающих при формировании комплексов на начальных этапах функционирования системы MMR из N. gonorrhoeae.
Научный коллектив в течение ряда лет разрабатывает подходы к изучению механизмов действия белков, образующих специфические комплексы с нуклеиновыми кислотами. В ходе исследований успешно применяются как физические, так и химические методы. Использование методов малоуглового рассеяния рентгеновских лучей, акустической детекции на пьезоэлектрическом сенсоре, «футпринтинга», аффинной модификации белка реакционноспособными ДНК и применение бифункциональных «сшивающих» реагентов позволило развить концепцию и предложить модель функционирования системы рестрикции-модификации SsoII. Созданы уникальные реагенты на основе нуклеиновых кислот, взаимодействующие c аминокислотой белка (лизин, цистеин, аргинин), сближенной с определенным фрагментом ДНК в процессе функционирования. Разработаны эффективные способы введения химически активных групп в разные позиции углеводофосфатного остова и гетероциклических оснований нуклеиновых кислот. Предложена стратегия изучения механизма функционирования белков системы репарации MMR, их комплексов друг с другом и ДНК. Она заключается в необратимой «химической» фиксации того или иного комплекса и анализе его свойств методом FRET. Продемонстрирована возможность получения конъюгатов на примере белка MutS из E. coli, очистки его от непрореагировавших компонентов – исходного белка и ДНК-фрагмента методом анионообменной хроматографии. Показано, что белок MutS в составе полученных конъюгатов сохраняет свою активность: находясь в ковалентном комплексе с ДНК, он способен «разгибать» ДНК после добавления АТФ. Таким образом, конъюгаты MutS-ДНК могут быть использованы для исследования их взаимодействия с другими белками-партнерами системы репарации «мисматчей». Впервые выделены белки MutL, MutS и бета-«зажим» из Rhodobacter sphaeroides, и продемонстрирована их активность.
Индийский институт науки, департамент биохимии | Соисполнитель |
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 18 июля 2017 г.-31 декабря 2017 г. | Характеристика взаимодействий между белками системы репарации «мисматчей» из бактерии Neisseria gonorrhoeae масс-спектрометрическим анализом ковалентно связанных биомолекул |
Результаты этапа: Проект направлен на исследование координации активности белковых компонентов системы репарации некомплементарных пар нуклеотидов (MMR) при инициации репарации ДНК у прокариот, в частности у патогенного для млекопитающих микроорганизма N. gonorrhoeae. Охарактеризованы плазмиды с генами, кодирующими рекомбинантные белки MutS, MutL (NgoL) и бета-«зажим» (бета-субъединица ДНК-полимеразы III) с шестью остатками гистидина на N-конце из бактерии Neisseria gonorrhoeae, которые были предоставлены нашим индийскими партнерами. Согласно их рекомендациям был получен препарат NgoL высокой степени гомогенности и показана его способность взаимодействовать с ДНК. Основным подходом, предлагаемым в данном проекте для изучения белковых комплексов, является метод ковалентного связывания (кросслинкинга) биомолекул с последующим трипсинолизом и масс-спектрометрической идентификацией продуктов «сшивки». Оригинальность нашей стратегии заключается в фиксации ключевого белка системы репарации MutS на ДНК. Для успешного осуществления предлагаемого подхода на первом этапе необходимо было разработать оптимальную методику проведения каждой отдельной реакции. В ходе тиолдисульфидного обмена с выходом 90% получен конъюгат белка MutS с реакционноспособным ДНК-лигандом - модифицированным 59-звенным дуплексом с G/Т-парой, содержащим пиридилдисульфидную группу. Разработана методика выделения ДНК-белкового конъюгата методом анионообменной хроматографии. Для кросслинкинга белков MutS и MutL нами применялись гетеробифункциональные реагенты, которые, возможно, позволят уменьшить количество внутрибелковых «сшивок». Для отработки методики использовали белки из E. coli: моноцистеиновый вариант MutL и мутантную форму белка MutS, не содержащую остатков Сys. Оптимальными условиями «сшивки» этих белков является использование N-оксисукцинимидного эфира 3-малеимидопропионовой кислоты при рН 7,5, наличие в реакционной смеси АТФ и протяженной 76-100-звенной ДНК, содержащей некомплементарную G/Т-пару. Для решения проблемы идентификации коваленно связанных пептидов после трипсинолиза конъюгатов предложены две схемы получения бифункциональных «сшивающих» реагентов, содержащих флуоресцентные красители (6-карбоксифлуоресцеин (FAM) и родамин В). Мы показали, что чем длиннее «мисматч»-содержащая ДНК, на которой идет сборка белкового комплекса, тем выше выход продуктов кросслинкинга. Для преодоления трудностей детектирования такого комплекса дуплексы для фиксации MutS должны иметь участок узнавания сайт-специфических эндонуклеаз рестрикции типа IIS. Такой прием позволяет гидролизовать ДНК в составе конъюгата и вводить на образовавшийся выступающий 5'-конец радиоактивную метку. Нами выделена и охарактеризована эндонуклеаза рестрикции типа IIS - BspD6II, имеющая преимущества перед коммерчески доступными изошизомерами. При формировании ДНК-связывающих центров MutS и MutL важны положительно заряженные аминокислотные остатки Arg. Для модификации гуанидиновой группы аргинина совместно с проф. Д.Н. Рао (Индия) было предложено использовать фрагменты ДНК, содержащие бета-дикетогруппу при С2'-атоме углеводного фрагмента. Впервые показано образование конъюгатов MutS и MutL с полученными модифицированными ДНК-дуплексами. | ||
2 | 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. | Характеристика взаимодействий между белками системы репарации «мисматчей» из бактерии Neisseria gonorrhoeae масс-спектрометрическим анализом ковалентно связанных биомолекул |
Результаты этапа: Изучена роль белков MuS и бета-«зажима» в связывании и гидролизе ДНК белком MutL из N. gonorrhoeae. Выполнен сравнительный анализ последовательностей MutS, MutL и бета-«зажима» прокариот, выявлены консервативные аминокислотные остатки, потенциально вовлеченные в ДНК-белковые и белок-белковые взаимодействия. Получены мутантные формы белков MutS и MutL из системы репарации MMR N. gonorrhoeae и E. coli без остатков цистеина, а также с единственным остатком цистеина для фиксации на ДНК. Проведено сравнение функциональной активности полученных мутантов с белками дикого типа. Проведена аффинная модификация одноцистеиновых мутантных форм MutL и MutS с помощью реакционноспособных ДНК, несущих пиридилдисульфидную или акриламидную группировки. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".