ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИСТИНА ПсковГУ |
||
Анализ смертности, сделанный ВОЗ, показывает, что основной причиной гибели человека в развитых странах является так называемый атеротромбоз, который относится к сосудистым заболеваниям, включающим в себя инфаркт миокарда и инсульт головного мозга разной природы. Патогенез этих заболеваний основан на ограничении доступа кислорода и питательных веществ в ткань за счет внезапной или развивающейся патологии сосудов. Состояние с такими ограничениями носит название ишемии (сердца, мозга, почек и пр). Очевидно, что из этого исходит высочайшая актуальность понимания не только механизмов повреждения при ишемии, но и путей по предотвращению повреждения ткани или ее репарации, если повреждение уже произошло. Весь набор данных, имеющихся на сегодняшний день, указывает на то, что повреждение ткани сочетается с повышенной генерацией т.н. активных форм кислорода (АФК) и других сигнальных молекул, которые при полной необходимости их существования в малых дозах, при повышении этих доз превращаются в молекулы-убийцы, терапия которых пока еще не разработана. Надо признаться, что фармакологическая терапия инфаркта миокарда крайне ограничена, а противоинсультные препараты почти все неэффективны. Однако сегодня ясно, что основным источником указанных молекул – убийц являются митохондрии. Из этого следует другой вывод о том, что основное внимание исследователей, должно быть направлено на понимание архитектуры митохондриальной деятельности и управление этой деятельностью. Мы предлагаем стратегию защиты от ишемического повреждения с четырьмя уровнями действий, которые в такой совокупности ее деталей еще никем не представлялись. Эта стратегия состоит в использовании: 1) природного механизма антиишемической защиты, в клинической практике передовых стран реализованной через т.н. ишемическое прекондиционирование ткани; 2) фармакологического прекондиционирования, сделанного на подробном анализе механизма ишемического прекондиционирования; 3) при неэффективности механизмов 1-2 использование клеточной терапии; 4) при недостаточности 1-3 подходов по возможности осуществления отмены приказа на гибель организма при полном понимании механизма феноптоза и роли митохондрий в программируемой гибели организма. В проекте будут подробно исследованы и реализованы подходы 1 и 2 и, возможно, частично амбициозная задача 4. В соответствии с этим ставятся следующие цели. 1. Исследовать механизм ишемического прекондиционирования почки и мозга. Разработать и предложить в качестве эффективных мер защиты удаленное прекондиционирование (почки и конечностей) для защиты головного мозга от повреждений разной природы (ишемия, болезни, травмы и пр) 2. В качестве имитации природного механизма ишемической защиты использовать ряд веществ, направленных на промежуточные и терминальные стадии сигнальных защитных механизмов, идущих с участием митохондрий. 3. Использовать накопленные знания по механизмам повреждения для предложения терапии ряда заболеваний мозга, почек и мочевого пузыря (ишемия, инсульт, пиелонефрит, рабдомиолиз, аденома простаты). 4. Систематизировать и дополнить имеющиеся в коллективе данные по роли митохондрий в гибели организма и рассмотреть возможность критической регуляции феноптоза со стороны иммунной системы при перенесении акцента на регуляторную роль митохондрий в процессе воспаления, определяющего гибель индивидуума (это направление будет носить поисковый характер). В проекте, почти на 90% проводимом молодыми научными сотрудниками (до 35 лет), будет использован арсенал физиологических, иммунологических, микроскопических и биохимических подходов. В целом проект надо рассматривать как фундаментально-прикладное исследование, на конечном этапе которого будут предложены конкретные действия по реализации антиишемической стратегии, а именно физические действия и руководство по их внедрению с определением митохондриальной мишени и фармакологических агентов, воздействующих на эту мишень в направлении уменьшения повреждения ткани и ее последствий.
В конечном виде работа будет оформлена как набор научных статей и отчета, в котором будет предложена стратегия и тактика антиишемической защиты, которая может быть реализована в клинической практике. Так как практически не существует противоинсультных лекарств, или их эффективность крайне мала, равно как и нет лекарств от ряда почечных патологий, сопровождаемых окислительным стрессом (напр. от рабдомиолиза или краш-синдрома, вызванного поражением мягких тканей, из-за сдавливания или ранения как результата природных или техногенных катастроф или военных действий), любое предложение на фармацевтическом рынке будет принято положительно. В конце проекта будет дано заключение о возможности представления митохондриальной киназы гликогенсинтазы как основной мишени для фармакологического воздействия в целях предотвращения нежелательной гибели клеток, органа и организма. В качестве модельных (а может быть и терапевтических) препаратов будут предложены препараты, составленные из комбинации солей лития или вальпроата и митохондриально-направленных веществ антиоксидантного характера или тех, которые не обладают антиоксидативным действием, но работают на уровне митохондрий, либо уменьшая эффективную продукцию АФК, либо не влияя на нее, но регулируя биоэнергетические параметры (в частности через т.н. «мягкое» разобщение окислительного фосфорилирования). Последние указанные механизмы разрабатываются в мире, в частности, в плане борьбы с ожирением (для уменьшения эффективности окислительного фосфорилирования в митохондриях, в результате чего основная энергия окисления тратится на теплообразование, а не на запасание в виде АТР), но наши данные указывают на возможность использования их в большем ряду патологий, включая и дегенеративные заболевания нервной и сердечно-сосудистой системы. У коллектива имеются недавно полученные патенты, реализация которых может позволить использовать соли лития как противоинсультные препараты (до сих пор они были разрешены для терапии психозов) по определенной схеме и в определенных дозах, для чего необходимо провести дополнительное исследование, запланированное в проекте. Ионы лития по общему заблуждению, несмотря на их высокий терапевтический потенциал, не имеют перспектив применения в фармакологии, прежде всего в силу их дешевизны и отсюда непривлекательности для фармацевтических компаний . Их использование в качестве нейролептиков также имеет старые причины, когда казалось, что основной мишенью ионов лития является Na, K ATPаза, что сейчас не отрицается, но дополняется основной мишенью – киназой гликогенсинтазы. Коллектив проекта в своем арсенале имеет достаточно доказательств высокой эффективности литиевых солей в лечении патологий митохондриальной основы. На рассмотрении находится заявка на патент, поданный авторами проекта, в котором предлагается возможность использования инфузионной формы гипертонического раствора соли лития для лечения отеков мозга. Именно отек мозга является причиной смертности при инсультах, травмах, интоксикации (включая алкогольную и наркотическую), и наши предварительные данные указывают на существенное уменьшение размера очага повреждения в мозге и сильное уменьшение неврологического дефицита в модельных экспериментах. Проведение широкомасштабного исследования, включая эксперименты на цитологических и физиологических моделях, позволит дать заключение об эффективности литиевых солей. Однако, понимая некоторую неприемлемость солей лития фармацевтикой в силу причины, указанной выше, мы рассматриваем в качестве альтернативы ионам лития ингибитор киназы гликогенсиназы, вальпроат, который может оказаться тем самым «нужным» терапевтически активным препаратом, который устроит фармацевтические компании. Надо отметить, что, исследуя кроме патологий мозга еще и патологии почек и отмечая, что в принципе основы стратегии защиты от повреждения почки одни и те же, что и у мозга и сердца, те же самые препараты могут быть рекомендованы для лечения ишемического, бактериального и токсического повреждения почек. Прежде всего, это может быть отнесено к терапии пиелонефрита и рабдомиолиза, смертность от которого достаточно высокая. Понимая, что рабдомиолиз, как мы уже отмечали, может иметь физическую (повреждение при сдавливании мягких тканей, полученных, например в завалах при землетрясениях, при разрыве мышечных связок или при ранении в военных действиях) или химическую (интоксикация) природу, это может быть привлекательным для организаций, занимающихся не только чисто медицинскими исследованиями, но и решением проблем, связанных с чрезвычайными ситуациями, военными и спортивными разработками, в области токсикологии и пр. Меры лечения пиелонефрита, не связанные с применением антибиотиков, за счет использования митохондриально-направленных веществ [2] и нетоксических ингибиторов киназы гликогенсинтазы позволят решить проблему невозможности или нежелательности использования антибиотиков у некоторых групп людей для лечения этой патологии (дети, беременные, аллергичные, устойчивые к антибиотикам и пр.). В фундаментальном плане будет выяснена роль протеолиза при рабдомиолизе и металлопротеиназ в ряде почечных патологиях, особенно в пиелонефрите, как способных расщеплять белки, придающие клетке устойчивость к гибели (таких как bcl-2 или bcl-xL). Это даст возможность использовать еще одну фармакологическую мишень, влияние на которую может обеспечить лучшее выживание после внесения патогенного начала. Более того, будет выяснено возможное разделение функций внеклеточных и митохондриальных металлопротеиназ. Особенно важным станет понимание механизма активации этих протеиназ, особенно за счет активных форм кислорода, что на данный день остается непонятным. Причем будет прослежена сигнальная цепочка от толл-подобных рецепторов до митохондриальных компонентов, отвечающих за энергетику и неэнергетическую сигнализацию, прежде всего связанную с генерацией губительного сигнала. Выяснение архитектуры такой цепочки событий позволит оценить возможность работы (путем фармакологического воздействия) со всеми компонентами этой цепочки в последовательности, определяемой последовательностью компонентов этой сигнальной цепи, главными узлами которой являются толл-подобные рецепторы – митохондрии - АФК – металлопротеиназы – белки защитники. Следующим результатом проекта в практическом плане будет обоснование по части исследованных механизмов предложение по технике использования удаленного прекондиционирования для лечения окислительных патологий органов (прежде всего мозга, сердца и почек, в частности при инсультах и инфарктах). Скорее всего будет предложена простая схема прекондиционирования конечностей (рук или ног). Но, понимая, что максимальная эффективность защиты, наверно, невозможно будет добиться за счет одного подхода (или ишемического или фармакологического прекондиционирования будет предложена комбинация из этих двух подходов). Мы планируем получить еще один результат, но в силу высокой амбициозности цели с пока еще не полным представлением механизмов и ставя эти исследования не во главу по очередности задач и затрат на нее сил, относя эти исследования к поисковым, эти результаты надо будет принимать с некой осторожностью, ибо потребуется много лет, пока не станет изученым более подробно механизм гибели организма. Наши данные о способности некоторыми агентами пресечь сигнал на программируемую гибель организма могут дать возможность новой и уникальной мишени воздействия в организме. Если наша точка зрения права и окажется, что гиперактивированная иммунная система в большинстве случаев является основной причиной гибели организма, то окажется, что мишенью для решения проблемы выживаемости является иммунная система. Какого рода иммунная система активируется – это предстоит выяснить, но при этом выяснении деталей сразу появятся те самые элементы этой системы, воздействие на которые может обеспечить уменьшение смертности. Насколько нам известно, последняя амбициозная задача в таком виде никем в мире пока не ставилась, хотя и известно, что при гиперактивации иммунной системы может произойти гибель организма. Как становится понятным из вышеизложенного, одним из основных акцентов проекта является рассмотрение роли воспаления в патологии мозга и выделительной системы и роли окислительного стресса и митохондрий как одного из источников этого стресса. Все эти компоненты с нашей точки зрения формируют и дополняют понятие митохондриальной медицины и сам по себе факт подтверждения исключительной важности этой, не очень признанной сферы, будет новым прорывом в организации медицинского процесса. Вообще, некая целевая сфокусированность проекта на выявлении механизма связки – митохондрии-воспаление позволит заполнить фундаментальную брешь в знаниях, по старинке относящих митохондрию к чисто энерго-продуцирующией органелле и дополнить уже наметившиеся альтернативные функции митохондрий еще одной функцией регуляции воспалительного процесса, которая может оказаться существенно более значимой и уникальной чем другие функции митохондрий.
грант РНФ |
# | Сроки | Название |
1 | 14 июля 2014 г.-31 декабря 2014 г. | Разработка базовых принципов антиишемической стратегии |
Результаты этапа: | ||
2 | 1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. | Исследование механизмов, лежащих в основе повреждения и репарации митохондрий при патогенном воздействии окислительного стресса, в частности при ишемии почки и окислительном повреждении почечных клеток. |
Результаты этапа: Этап выполнен полностью | ||
3 | 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. | Роль митохондрий в повреждении и репарации клетки |
Результаты этапа: Разработана новая схема ишемического прекондиционирования почек крыс, позволяющая обеспечить высокую степень защиты почки от ишемического повреждения, которая перспективна в смысле внедрения в клинику. Суть схемы состоит в том, что в отличии от достаточно стандартной схемы (5 минут ишемии и 5 мин реперфузии, и таких циклов 3), осуществляется 3-цикловая прекондиция, но каждое время ишемии и времени восстановления кровотока составляет 15 секунд. Использовался метод допплерографии, доказывающий, что кровоток через почку прекращается или восстанавливается и была исследована возможность обеспечения защиты почки от ишемического повреждения у старого животного за счет прекондиции почки. Были выбраны две модели старых животных – беспородные белые крысы возрастом 1,5-2 года и полугодовалые крысы линии OXYS, проявляющие признаки преждевременного старения – прежде всего выражающиеся и легко идентифицирующиеся наличием катаракты, обычно присущей старым организмам и другим субъективным (поседение, кефоз и другим внешним признакам). Так как базой для выведения OXYS были взяты крысы линии Wistar, для контрольной «молодой» группы выли выбраны именно животные этой группы. Показано, что зажим клипсами пучка почечных сосудов приводит к полной остановке кровотока, а его восстановление приводит у молодых крыс (3 мес) к ослаблению кровотока по сравнению с доишемическим периодом. Такое ослабление почти незаметно, если до эпизода ишемии почку прекондиционировали ультракороткими эпизодами ишемии/реперфузии (по 15 сек каждый). У старых крыс кровоток в результате этой процедуры почти не меняется. Но если прекондиционирование у молодых крыс просто восстанавливало предишемический уровень, то у старых животных кровоток мало изменялся в постишемический уровень, а после прекондиции даже увеличивался, причем почечная недостаточность наблюдалась приблизительно в одинаковой степени как у молодых, так и у старых крыс. При этом, прекондиция улучшала функционирование у молодых, но не у старых (1,5-2 г) или OXYS (6 мес), причем то, что защищает у молодых становится даже усугубляющим фактором у старых. Видимо именно этим объясняется гиперперфузия при прекондиции почек старых крыс – как способ в качестве защиты компенсаторно обеспечить увеличение кровотока в силу невозможности включить сигнальную систему индукции защиты. При выяснении причин таких различий, обнаружено, что уровень ацетилирования белков почки возрастает после ишемического повреждения и нормализуется при прекондиционировании почки. У старых и OXYS крыс, прекондиционирование вызывало даже увеличение уровня ацетилирования, в результате чего сам процесс ацетилирования теперь нами рассматривается как повреждающий, патогенный фактор. Предполагая, что степень повреждения клетки зависит от способности удалять поврежденные элементы через аутофагию, обнаружено, что аутофагия повышается при ишемическом повреждении и нормализуется при прекондиционировании. У OXYS в почке уровень ацетилирования белков стабилен и не отвечает на воздействия, что говорит об уменьшении или уничтожении ответа системы на окислительные вызовы, при этом система первичного ответа на повреждения, видимо, присутствует, так как уровень убиквитирования и белка, способного осуществлять связь убиквитирования с наличием низкопотенциальных митохондрий, возрастает. Количество митохондрий с низкими значениями мембранного потенциала у старых и OXYS крыс растет. Все эти данные свидетельствуют о том, что повреждение при ишемии/реперфузии видимо в основном затрагивают митохондрии, а именно за счет появления нефункциональных, неутилизованных митохондрий возникает патология. Накопление таких митохондрий видимо приводит к почечной недостаточности. На основании таких результатов была поставлена задача провести анализ механизма повреждения при старении биологической системы. Основой анализа стал процесс фрагментации всей популяции митохондрий, который мы открыли в 1983 году. Этот процесс был вызван добавлением разных веществ, среди которых большинство митохондриальных ингибиторов или физических факторов, вызывающих окислительный стресс. Процесс неравного разделения митохондриального содержимого при фрагментации оставался невыясненным. Этот процесс расщепления приводил к образованию внутренних септ, образованных внутренними митохондриальными мембранами с единой внешней мембраной и разделяющих матрикс на отсеки с разными конфигурациями, означающими, что одна часть митохондриального отсека по всем признакам соответствовала полностью энергизованным митохондриям, а вторая часть частично, или полностью энергизованным митохондриям. Анализ причин такого несимметричного деления дал возможность сформулировать концепцию механизма выделения поврежденных структур в системе. Был поставлен более глобальный вопрос: стареют ли митохондрии и если да, то есть ли у этого процесса биологические часы. Для ответа на этот вопрос мы обратились к бактериям, у которых было признано наличие процесса старения, причем это ассоциируется с асимметрическим делением клеток. Если митохондрии, являющиеся эволюционными предшественниками митохондрий, унаследовали такой же принцип асимметрии деления, то мы наблюдали проявление этого принципа при фрагментации митохондрий. В соответствии с этими представлениям мы предложили концепцию, заключающуюся в том, что вначале внутри митохондрии по разным причинам происходит повреждение структур, которые, если не могут быть репарированы, разделяются внутри митохондрий с образованием септы, отделяющей поврежденное содержимое от интактных частей с последующим отпочкованием поврежденной части с ее дальнейшей утилизацией. Для понимания, что же из себя представляют т.н. «плохие» митохондрии, надо научиться оценивать их качество, для чего надо было максимально полно отразить состояние митохондриального хондриома с оценкой функционального состояния членов этого хондриома. Для такой оценки были опробованы три подхода к анализу структурной организации митохондрий клеток в норме и при фрагментации, индуцированной окислительным стрессом. В работе было выявлено, что наиболее информативным способом анализа является трехмерное реконструирование на основе серии конфокальных изображений по оси Z, однако с рядом ограничений возможно применение и более простых систем анализа, в том числе и по единичным двухмерным изображениям. На сегодняшний день эти морфологические подходы вкупе с измерением мембранного потенциала могут рассматриваться как диагностический признак, отражающий реакцию митохондрий на окислительные вызовы, которая состоит из изменений трехмерной структуры митохондрий и их функциональной активности, выраженной в значении мембранного потенциала на внутренней митохондриальной мембране. Было показано, что митохондриально-направленные антиоксиданты частично предотвращают структурные изменения в хондриоме при окислительном стрессе, что указывало на первичность и максимальную важность активных форм кислорода в этих изменениях. Учитывая, что активные формы кислорода играют также и важную роль в индукции воспаления, была оценена такая связь, на примере генерации воспалительного ответа при пиелонефрите. В созданной ранее нами клеточной модели пиелонефрита основой была первичная культура эпителия почечных канальцев, культивируемая вместе с мононуклеарными лейкоцитами в присутствии бактериального лизата или липополисахарида (ЛПС). При сокультивировании клеток почки, лейкоцитов и бактериального лизата в почечных клетках наблюдались провоспалительные изменения, сопровождаемые окислительным и нитрозильным стрессами и гибелью клеток, частично опосредованной сигнализацией через Toll-подобные рецепторы (TLR2 и TLR4). Активация этих рецепторов приводит к увеличению уровня окислительного стресса и синтеза провоспалительных цитокинов (TNFα, IL-6, IL-1α) в почечном эпителии, а блокада TLR4 – к снижению выраженности этих процессов. Повышение содержания IL-1α в ядрах сопровождается увеличением ацетилирования белков ядра, которое снижается до контрольных значений при обработке защитными агентами (Trolox, митохондриально-направленный антиоксидант SkQR1 и LiCl). Вероятно, уровень ацетилирования гистонов, регулируемый провоспалительным цитокином, в некоторой степени является маркером воспаления, которое опосредованно может быть снижено защитными агентами. Учитывая, что при ишемии ткани первыми на себя принимают гипоксический удар клетки эндотелия, выстилающего сосуды, в данной работе для оценки состояния эндотелиальных клеток сосудов мы использовали метод электронной микроскопии с максимальной оценкой состояния митохондрий, но и в целом были исследованы функциональные и морфологические нарушения, возникающие после ишемии/реперфузии почки в эндотелии почечных сосудов, и проанализирована возможность уменьшения степени тяжести этих изменений с помощью митохондриально-направленного антиоксиданта пластохиноил-децилродамина 19 (SkQR1). Было показано, что 40 мин ишемии и 10 мин реперфузии почки приводит к выраженному изменению структуры митохондрий эндотелиоцитов, что сопровождается вазоконстрикцией сосудов почки, уменьшением почечного кровотока, повышением сопротивления сосудистого русла и увеличением количества циркулирующих в крови эндотелиальных клеток. Инъекция SkQR1 улучшает восстановление почечного кровотока и уменьшает сосудистое сопротивление почки в первые минуты реперфузии, а также снижает тяжесть почечной недостаточности и нормализует проницаемость сосудистого русла почки через 48 ч после И/Р. В экспериментах in vitro SkQR1 защищал клетки эндотелия от гибели, спровоцированной кислородно-глюкозной депривацией. Сделан вывод, что дисфункция и гибель эндотелиоцитов играет важную роль в развитии реперфузионного повреждения почечной ткани. Результаты показывают, что основным патологическим началом в повреждении эндотелия является окислительный стресс и повреждение митохондрий эндотелиоцитов, поэтому митохондриально-направленные антиоксиданты могут служить эффективным инструментом защиты от негативных последствий ишемии. Так как не только митохондриально-направленные антиоксиданты, но и их производные, не обладающие антиоксидативной активностью, являются протекторами, было исследовано проникающее производное флуоресцеина на предмет защиты головного мозга от ишемического поражения, и было показано, что это производное обладало свойствами уменьшения последствий повреждения головного мозга при экспериментальной травме головного мозга, оцененными по размеру отека мозга и степенью неврологического дефицита. Проведенный в данной работе биоинформатический анализ пока не дал прямолинейного ответа, существует ли CRISPR-подобная иммунная система в митохондриях. Однако, это не исключает возможности существования митохондриального иммунитета, который может быть трудно обнаружим или основываться на других принципах. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".