ИСТИНА

Цель запланированного проекта - детальное изучение влияния модуляций уровня серотонина и процесса серотонилирования на разных фазах жизненного цикла, на онтогенез серотонинергической нервной системы на примере полихеты D. gyrociliatus с коротким жизненным циклом. Данное исследование станет продолжением диссертационной работы, посвященной анализу формирования нервной системы ( в том числе и серотонинергической) у динофилид. Для выполнения поставленной цели будет проведено: 1) Подробное описание самых ранних этапов нейрогенеза с использованием комбинации цитохимического маркирования и фунциональной активации серотонинергической системы (системы активации синтеза/захвата серотонина). Особое внимание будет уделено локализации и морфологии серотонинергических нейронов; 2) Биоинформационный анализ системы синтеза, захвата серотонина, возможного моноаминилирования у полихет; 3) Функциональный анализ системы синтеза и захвата серотонина в норме и при блокаде серотонилирования на разных этапах онтогенеза; 4) Проведение физиологических экспериментов по сравнению паттернов локомоторной активности при повышении/понижении уровня серотонина, а также при усилении/угнетении моноаминилирования на разных стадиях онтогенеза; 5) Подробное описание этапов деградации нервных клеток в онтогенезе Dinophilus gyrociliatus с использованием комбинации цитохимического маркирования и функционального анализа, установление роли серотонилирования в этом процессе. 6) Выявление уровня серотонилирования на разных стадиях онтогенеза и при разных экспериментальных условиях, сопоставление его с морфологическим и поведенческим паттернами в онтогенезе.

Ontogenesis of the nervous system, the initiation of neuronal differentiation, their assembly into coherently functioning structures, mechanisms and causes of neuronal degradation - these are the main issues facing neurobiologists. A significant breakthrough has occurred in this direction both in connection with the emergence of transgenic animals and with the accumulation of new data on the role of neurotransmitters, in particular, serotonin, in the regulation of these key neurogenetic processes. It was shown that serotonin acts not only as a receptors ligand but also as a biochemical substrate for the transamidation inside the cell (serotonylation). As a result, the functional activity of the entire developing nervous system (Ivashkin et al., 2015) and the expression of transcription factors in serotonergic neurons (Farrelly et al., 2019) changes. In contrast, inhibition of monoaminylation contributes to better survival of nerve cells in the model of Parkinson's disease and Huntington's syndrome (Borrell-Pagès M et al., 2006; Tremblay M-È et al., 2006). To investigate the long-term processes occuring within neurons during different phases of the life cycle, model invertebrate animals with identifiable neurons have been successfully used. Dinophilid polychaetes represent one of such models, which have a short life cycle, successfully culturing in the laboratory and soft cuticles easily penetrated by various pharmacological agents. The goal of the current project is detailed study of the of the serotonin modulation and serotonylation during different phases of the life cycle, and their effects on the serotonergic neurons ontogenesis (from the initiation of cell differentiation till the neuronal degradation) using immunochemical and biochemical approaches. We planned to conduct: 1) a morphological and functional analysis of dinofilid early ontogenesis in order to establish the time and location of early neurons differentiation, 2) to test the functional activity of the serotonin synthesis and reuptake system at different stages of ontogenesis, 3) to follow the fate of the identified neurons during the entire ontogenesis, both in normal development and under serotonin level decreases and increases, as well as inhibition of serotonylation, 4) to determine the level of serotonylation in different periods of ontogenesis and to reveal the corresponding changes in serotonin synthesis and reuptake system functioning in neurons, and accompanying disturbances in the locomotor cilia activity, 5) to trace the correlation between the level of serotonylation and the duration of active functioning of the identified serotonergic cells. A comparison of the neurogenesis patterns and the biochemical characteristics of neurons, under conditions of serotonin levels modulation and serotonylation inhibition, will demonstrate the contribution of this non-canonical pathway of monoamines functioning to the maturation and degradation of neurons.

В результате выполнения данного проекта будет получено детальное морфологическое описание онтогенетического паттерна нейрогенеза D. gyrociliatus с момента дифференцировки первых нервных клеток до деградации нервной системы. Будут установлены ключевые зоны закладки основных нейрональных структур и предположительные механизмы навигации и миграции нервных клеток в места будущего формирования ганглиев. Впервые будет прослежен возрастной паттерн локомоторной активности в онтогенезе. Впервые будет показано воздействие серотонина, его предшесвенника, блокатора синтеза серотонина (PCPA) и блокатора серотонилирования на разных этапах онтогенеза с эмбриональной стадии до стадии престарелого животного. Будет определена способность клеток к захвату и синтезу серотнина на разных этапах онтогенеза, начиная с эмбрионального периода до периода старения. Эти паттерны будут сравнены у особей разного возраста. В результате длительных экспериментальных воздействий будет определено влияние пониженного/повышенного уровня серотонина и его биохимического предшественника на активность особей на разных стадиях онтогенеза, начиная с эмбрионального периода до периода старения. Будет установлено влияние повышенного/ пониженного уровня серотонина на ход онтогенеза в результате длительных экспериментов. Кроме того будут определены возрастные паттерны локомоторной активности в онтогенезе модельной полихеты, прослежены изменения во влиянии серотонина на паттерны локомоторной активности в ходе онтогенеза. Будут получены паттерны локомоторной активности при аппликации серотонина особям, развивавшимся на фоне пониженного уровня серотонина. Будут выявлены и детально описаны признаки старения у D. gyrociliatus. Будут определены паттерны деградации нейронов в связи со старением и с наступлением скорой смерти. Будут описаны возрастные паттерны серотонилирования, прослежена связь с функциональной активностью. Биоинформационный анализ системы синтеза, захвата серотонина, возможного серотонилирования у полихет покажет присутствие или отсутствие ортологов генов рецепторов серотонина, серотонинового транспортера, трансглутаминазы. Следует отметить, что отсутствие ортологов данных генов не означает отсутствие рецепторов, транспортера и трансглутаминазы. Реализация данного проекта добавит в современную биологию новый модельный объект, отличающийся отсутствием плотных хитиновых покровов, проницаемостью для водорастворимых веществ, короткой продолжительностью жизни, доступность в условиях лабораторной культуры. Все это позволяет использовать Dinophilus для быстрой оценки влияния веществ на целый организм, что ценно для современной фармакологии. Появляется огромное количество веществ, которые необходимо тестировать. Тестирование на культурах клеток не дает представления о влиянии на организм в целом, а тестирование на лабораторных позвоночных длительное и дорогостоящее. Поэтому актуален поиск модели, на которой возможно быстро и относительно недорого оценить степень влияния вещества на целый организм. Кроме того динофилиды давно и с успехом использовались в экотоксикологических тестах, проявив себя удобной и точной моделью. Новые модели, с отработанным комплексом методов позволят вести дальнейшую экспериментальную работу с этими животными в рамках курсов по сравнительной морфологии, эмбриологии и физиологии беспозвоночных в учреждениях высшего и среднего образования. В ходе выполнения данного проекта будет наработан массив уникальных данных, ценных для сравнительной эмбриологии беспозвоночных, который можно будет использовать при составлении определителей.

Руководитель проекта имеет опыт проведения сравнительно-морфологических и экспериментальных исследований на эмбрионах, ювенильных и взрослых особях морских беспозвоночных. Лаборатория исследовала нейрогенез D. gyrociliatus и D. taeniatus от стадии поздней трохофоры до взрослой особи (Kerbl A., Fofanova E., et al. 2016), создав подробный атлас нервной системы. Для Dinophilus аннотирован транскриптом, а новейшие данные о D. gyrociliatus будут получены благодаря сотрудничеству с ведущими мировыми лабораториями. Это позволит провести биоинформационный анализ и выбрать гены интереса. Руководитель успешно применяет конфокальную микроскопию, прижизненную регистрацию поведения и фармакологические эксперименты (Fofanova, 2012; Kerbl A., Fofanova E., et al. 2016; Fofanova et al., 2017). В 2017 году он прошел курс СПБГУ «Современные методы протеомики и белковой химии» и продолжает совершенствовать навыки в лаборатории сравнительной нейробиологии развития ИБР РАН. У руководителя есть методические наработки по работе с культурой Dinophilus gyrociliatus. Разработаны протоколы иммуномаркирования для всех стадий развития, методы фармакологического воздействия на морских беспозвоночных и эксперименты с агонистами и антагонистами рецепторов. Имеются предварительные результаты о захвате серотонина и его предшественников клетками, а также наблюдения за изменениями в организме D. gyrociliatus, включая истощение ооцитов и нарушения электролитного баланса. Руководитель имеет опыт работы с микроскопами Leica, Zeiss, Nikon и программами для получения 2D и 3D изображений, а также успешный опыт публикации результатов и выступлений на научных конференциях.