ИСТИНА

Переход к неинвазивным протоколам контроля биохимических показателей является мировым трендом и требованием времени. При этом ряд задач, включая мониторирование глюкозы больными диабетом (особенно во сне), отслеживание состояний гипоксии при физических или эмоциональных нагрузках, подразумевают непрерывный мониторинг метаболитов и стабильность характеристик сенсорных устройств во времени. В настоящем Проекте задача создания точных устройств для непрерывного контроля метаболитов будет впервые рассмотрена с позиций новых режимов регистрации и обработки сигнала. Реализация таких режимов для биосенсорных платформ на основе каталитических миметиков пероксидазы и различных ферментов, включая оксидазы и дегидрогеназы, обеспечит ряд преимуществ перед традиционными стационарными подходами: в сотни раз улучшенную операционную стабильность, возможность коррекции сигнала с учетом инактивации сенсорного покрытия, функционирование устройства независимо от скорости потока (в условиях изменяющейся секреции биологической жидкости или при активном движении пользователя).

The project is aimed at development of wearable metabolite analyzers for non-invasive personalized diagnostics. While researchers are traditionally focused on developing the biosensor component of the analyzer, standard steady-state chronoamperometry/potentiometry modes are generally used for the readout. With the Project, in addition to the next-generation biosensor materials elaboration, we propose advanced electrochemical modes for their reliable functioning as part of wearable devices. The ultrashort pulses mode will ensure operation of amperometric sensors under conditions close to kinetic control, thereby increasing sensitivity and minimizing the dependence of the response on hydrodynamic conditions. In addition, pulse amperometry will significantly reduce the inactivation of the sensing layer, providing efficient transport of the product from its surface. To correct the effects caused by variable convection conditions or sensor inactivation, the modes of synchronous multichannel signal registration and processing will be proposed. The listed approaches will be implemented both for systems with model redox mediators and adapted for enzyme-containing biosensor platforms (using enzymes oxidases, glucose dehydrogenases and bienzyme fuel cells based on them) developed for monitoring key metabolites (glucose and lactate). As a more efficient peroxidase analogue, Prussian Blue based catalytic biomimetics will be used. The synthesis of nanoparticles with molecular imprints of hydroperoxides would allow to regulate their microporosity, and therefore the efficiency of transport in the bulk of the biomimetic and its integral activity. To establish the peculiarities of such nanomaterials formation by catalytic and traditional approaches, a spectroelectrochemical study will be carried out using Raman spectroscopy, as well as the synthesis of biomimetics will be carried out with in situ spectroscopic control in specially designed microfluidic cells. Biosensors for detecting metabolites with a “tunable” operating range will be developed based on catalytic mimetics and oxidase enzymes. The linear range of the sensor will be controlled by both varying the composition of the enzyme-containing coating and using the proposed pulse readout modes. The adaptability of biosensor platforms would allow to use them for a wide range of tasks: from blood analysis to monitoring of sweat composition. A next-generation biosensors based on glucose dehydrogenases and polyazine dyes containing the fragments of the enzyme substrates, will be elaborated. The implementation of ultrashort pulses for the systems operated through direct bioelectrocatalysis by glucose dehydrogenases would allow to overcome the key problem hindering their mass production - rather low catalytic activity of immobilized enzymes (especially FAD-dependent ones). Matching the characteristics in pulse modes for the biosensors based on oxidases and dehydrogenases, operated by principally different mechanisms of coupling the enzymatic and electrode reactions, would allow to distinguish physicochemical patterns and limitations of their work. As a result, biosensor platforms (including those operated similarly to the fuel cell) will be developed for a wide range of diagnostic applications, including continuous metabolite monitoring systems and test strips. Upon completion of work on optimizing pulse modes, the developed biosensors will be tested as part of wearable analyzers of glucose and lactate in sweat. The proposed modes will be implemented in a compact gadget that transmits readings to a mobile phone in real time. It would demonstrate the advantages of new regimens for non-invasive control of hyperglycemia and hypoxia compared to traditional steady-state chronoamperometry.

Ожидается, что в результате выполнения Проекта будут получены следующие ключевые результаты, имеющие как фундаментальное, так и практическое значение. 1. Реализован режим амперометрической регистрации ультракоротких электрохимических импульсов для (био)сенсорных платформ. Режим высокоскоростной регистрации последовательности импульсов тока (в том числе короткого замыкания) не имеет аналогов даже среди методов, реализованных в профессиональном электрохимическом оборудовании международного класса. Реализация такого режима позволит решить как фундаментальные задачи, связанные с установлением ключевых факторов, определяющих скорость электродных реакций, так и обеспечить ряд преимуществ для прикладных задач анализа метаболитов, включая мониторинг анализируемого вещества в условиях, близких к кинетическому контролю, и не ограничиваясь следующими: - увеличение чувствительности биосенсоров до рекордных значений при минимальном расходе анализируемого вещества на поверхности сенсора, - существенное снижение зависимости отклика сенсора от скорости потока – и, как результат, возможность работы в условиях изменяющейся интенсивности секреции биологической жидкости или во время активного движения, - улучшенная на несколько порядков величины операционная стабильность за счет устранения эффектов ингибирования продуктом, - возможность коррекции сигнала с учетом изменяющихся в ходе измерения характеристик сенсоров, включая фоновые значения тока или инактивацию покрытия, - управление рабочим диапазоном сенсора за счет регуляции соотношения диффузионно и кинетически контролируемых компонент тока путем изменения интервалов замыкания/размыкания цепи и времени считывания сигнала. Помимо этого, будут реализованы сложные импульсные режимы, включая регистрацию последовательностей импульсов с разверткой по их продолжительности/скважности, а также режим с предварительным обеднением приэлектродного слоя по аналиту. Такие режимы обеспечат управление диффузионной и кинетической компонентами тока и сделают возможным создание «самокалибруемых» датчиков, а также реализацию амперометрического аналога импедансной спектроскопии. 2. Синтезированы и исследованы с использованием современных физико-химических методов новые сенсорные материалы, включая: - каталитические миметики на основе берлинской лазури с молекулярными отпечатками гидропероксидов, - полимерные проводящие наноструктуры на основе красителей азинового ряда для «заякоривания» ферментов глюкозодегидрогеназ на поверхности сенсора и их ориентации, оптимальной для прямого транспорта электронов между электродом и ферментом. Проведение синтеза и исследования электроактивности материалов в ходе in situ спектроэлектрохимических измерений с использованием подходов спектроскопии комбинационного рассеяния позволит выявить закономерности и оптимальные условия/ограничения их функционирования для (био)сенсорных приложений. 3. Созданы высокостабильные биосенсорные платформы для длительного непрерывного контроля метаболитов в биологических жидкостях, реализуемых за счет: - использования стабильных каталитических миметиков на основе неорганических наночастиц вместо фермента пероксидазы, - варьирования состава фермент-содержащей мембраны, - импульсной регистрации сигнала. 4. Разработан новый класс безмедиаторных биосенсоров на основе глюкозодегидрогеназ, работающих в режиме гальванической ячейки, аналогично топливному элементу. Включение глюкозодегидрогеназ в прямой биоэлектрокатализ обеспечит протекание реакции в соответствии с термодинамикой редокс-реакций кофактора – и, как результат, возможность работы при оптимальных для ферментов потенциалах (около 0 В и ниже относительно серебряного электрода или электрода на основе берлинской лазури) в режиме короткого замыкания цепи. Адаптация импульсных режимов для таких систем впервые позволит применять их как в системах непрерывного контроля глюкозы, так и в тест-полосках. Применение анодов на основе глюкозодегидрогеназ и катодов на основе глюкозооксидазы и каталитических миметиков пероксидазы сделает возможной работу такой биферментной системы по принципу топливного элемента. В перспективе функционирование сенсора подобно топливному элементу обеспечит его частичную или полную энергоавтономность. 5. Реализованы мультиканальные микроконтроллеры для одновременной регистрации и передачи нескольких сигналов. Применение сенсорных платформ на основе как нескольких отдельных, так и мультиканальных микроконтроллеров обеспечит синхронную многопараметрическую регистрацию сигналов. Мультиканальная регистрация в режиме реального времени, с одной стороны, сделает возможным коррекцию электрохимического отклика в ходе долговременного использования сенсора, с другой – расширит функционал нательных мониторов и обеспечит соотнесение различных физиологических закономерностей. 6. Изготовлено компактное нательное устройство для неинвазивного контроля метаболитов в поте, поддерживающее режимы регистрации ультракоротких импульсов/мультиканальной регистрации и передачи данных на смартфон пользователя в режиме реального времени. Показаны преимущества новых режимов для неинвазивного контроля гипергликемии и гипоксии в сравнении с традиционной стационарной хроноамперометрией. Универсальность и адаптивность микроэлектронного устройства открывает широкие перспективы его применения как для телемедицинской диагностики, так и других электроаналитических задач, не ограниченных тематикой данного Проекта.

Проект является продолжением фундаментальных и прикладных исследований по созданию (био)сенсорных систем и персональных электроанализаторов на их основе. У коллектива имеется большой опыт совместной работы, в том числе получены следующие результаты. Синтезированы каталитические миметики пероксидазы с рекордной стабильностью и в 100 раз более высокой константой скорость-лимитирующей стадии, по сравнению с ферментом. На основе каталитических миметиков «искусственная пероксидаза» разработаны биосенсорные платформы с рекордными аналитическими характеристиками, включая системы «энзим-нанозим» и ДНК-сенсоры. Разработаны биосенсоры на основе пирролохинолинхинон-зависимой глюкозодегидрогеназы и полиазиновых красителей для контроля состояний гипо/гипергликемии по анализу пота. Для увеличения соотношения сигнал/шум и упрощения устройства регистрации сигнала предложен режим генерации мощности. Показана необходимость контроля вкладов процессов конвекции, диффузии и электродной кинетики для корректной трактовки откликов (био)сенсоров в условиях ограниченного массопереноса, для снижения ограничений по аналиту и субстрату предложен режим импульсной амперометрии. С целью создания инструментов неинвазивной диагностики разработан нательный электроанализатор для in situ мониторинга гипоксии в ходе физической нагрузки. С опорой на результаты одновременного непрерывного мониторинга лактата и скорости экскреции пота сделан вывод о их независимости, что свидетельствует о диагностической ценности лактата как маркера гипоксии. Показаны преимущества использования импульсной амперометрии для увеличения чувствительности (до 100 раз) и снижения зависимости отклика биосенсора от скорости экскреции пота. С помощью нательного импульсного монитора показано, что динамика концентрации глюкозы в поте не только изменяется без существенных временных задержек относительно крови, но реагирует на изменения глюкозы быстрее, чем подкожный датчик FreeStyle Libre, который имеет задержку на 15-20 минут.