ИСТИНА

Изучение возможностей неорганических наночастиц в методах люминесцентного определения биологически активных, в том числе лекарственных, веществ

The development of new approaches in the field of personalized medicine and health care is inextricably linked with the development of means and methods of chemical analysis that provide information on the content of medicinal and other biologically active substances in medical samples, pharmaceuticals and other objects. Screening methods are of great importance as far as they allow to conduct a relatively simple and quick preliminary assessment of the content of target substances in the object of analysis in order to decide on the advisability of its further detailed analysis using powerful and expensive methods. The main requirements for preliminary screening methods are high sensitivity, rapid determination, simplicity and mobility of the equipment used, low cost and environmental safety of the reagents. Analytical methods that meet these requirements include luminescence spectroscopy. This method has long been successfully used for the sensitive determination of various biologically active substances. It is advisable to investigate new luminescent reagents and preliminary sample preparation procedures for development of this method. Of particular interest in this regard are nanoobjects, which have been actively studied recently as an alternative to traditional reagents and sorbents. Thanks to their non-classical properties, these objects make possible both improving the characteristics of known approaches and implementation of new analytical procedures. The goal of this project is to study the capabilities of inorganic nanoparticles in methods for the luminescent determination of biologically active substances, including medicinal substances. The project intends to consider inorganic nanoparticles both as direct luminescent reagents and as a tool to simplify sample preparation before analysis. In the first case, silicon nanodots will be studied. These environmentally friendly nanoobjects have their own luminescence, which is easily excited in the visible range of the spectrum. This fact reduces the requirements for the excitation source and the equipment used. Moreover, the presence of a large number of active functional groups on the surface of nanoparticles is favorable from the point of view of interactions with various organic molecules. Preliminary data, in particular, indicate the possibility of luminescent determination of such vital hormones as catecholamines with their help. Another type of promising nanoobjects that is expected to be studied are copper nanoclusters. Compared to the well-known luminescent silver nanoclusters, copper nanoclusters have been studied relatively little. At the same time, they may be of interest due to their excellent spectral characteristics, selectivity, and the significantly cheaper precursor used for their synthesis. Their important feature is increased selectivity for sulfur-containing substances. As part of the project, the capabilities of these nanoobjects will be studied to solve the problems of determining sulfur-containing amino acids. Sample preparation plays a major role in luminescence spectroscopy, allowing both to increase the sensitivity of the analysis due to concentrating procedures and to reduce the interfering influence of the components of the object matrix. The sorption properties of nanoparticles can be effectively used to increase the efficiency of this stage of analysis. This project involves the development of sorption systems based on inorganic nanoparticles for the extraction and concentration of luminescent substances. In order to simplify the sample preparation procedure, we will consider sorbents based on superparamagnetic magnetite nanoparticles, which make possible rapid separation of concentrated analytes using the method of magnetic solid-phase extraction. As part of the project, it is planned to evaluate the effectiveness of these sorbents in relation to the luminescent determination of antibacterial substances of the tetracycline class.

По итогам выполнения проекта будут: – Cинтезированы и охарактеризованы с точки зрения аналитических свойств кремниевые наноточки, модифицированные на поверхности аминогруппами. Кремниевые наноточки представляют из себя экологически дружественные нанообъекты, обладающие выраженными люминесцентными свойствами – применение их для целей химического анализа способно упростить и повысить доступность аналитических процедур при определении биологически важных веществ. – Получены и детально охарактеризованы новые сенсорные аналитические системы на основе нанокластеров меди, детально изучены возможности использования нанокластеров меди для люминесцентного определения таких приоритетных биологически активных соединений, как серосодержащие аминокислоты. Это позволит применить выявленные закономерности для создания новых оптимизированных подходов к решению задач определения лекарственных веществ. – Предложены сорбционные системы на основе суперпарамагнитных наночастиц магнетита для выделения и концентрирования люминесцирующих веществ. Помимо магнитных свойств наночастицы магнетита обладают уникальными сорбционными свойствами, которые обеспечивают селективные взаимодействия с определенными классами веществ, например, с тетрациклинами. В рамках проекта будут систематически исследованы основные факторы, влияющие на сорбцию тетрациклинов, полученные данные будут положены в основу разработки методик люминесцентного определения тетрациклинов после их выделения на магнитных наночастицах из объектов окружающей среды или пищевых продуктов.

Руководитель проекта имеет богатый опыт работы с нанообъектами различной природы (золотые наночастицы, наностержни золота и серебра, люминесцентные нанокластеры золота), а также имеет определённый задел по использованию различных наночастиц в спектрофотометрии и люминесцентной спектроскопии. Другие члены коллектива также в своей работе успешно использовали наночастицы для разработки спектрофотометрических методик определения различных соединений, а также для целей разделения и концентрирования. К настоящему моменту научный задел по теме проекта состоит в том, что были начаты исследования о возможности использования неорганических наночастиц для люминесцентного определения различных соединений: научным коллективом предложены способы определения аденозинтрифосфата и глутатиона с использованием различных систем на основе неорганических наночастиц. Оптимизирована методика получения суперпарамагнитных наночастиц магнетита, у исполнителей имеется опыт работы в области магнитной твердофазной экстракции с полимерными магнитными сорбентами. Получены первые положительные результаты, свидетельствующие о перспективности применения наноразмерного магнетита для выделения тетрациклинов. В научной группе проводились работы по сочетанию магнитной твердофазной экстракции со спектрофотометрическим определением лекарственных веществ.

В ходе работы продемонстрировано, что взаимодействие дофамина с флуорескамином может быть положено в основу люминесцентного определения дофамина с использованием фотоаппарата, поскольку образующийся в результате этого взаимодействия продукт характеризуется максимумом люминесценции в видимой области спектра (485 нм), для возбуждения люминесценции достаточно светодиода, излучающего свет в ближней ультрафиолетовой области (395 нм). Выбраны условия определения, оценены аналитические характеристики (предел обнаружения 1.8 мкМ, диапазон определяемых содержаний 5.4–50 мкМ), предлагаемый способ применим для контроля качества лекарственных препаратов. Показана возможность получения люминесцирующих кремниевых наноточек со средним диаметром 3.2 нм при использовании в синтезе в качестве прекурсора кремния аминопропилтриэтоксисилана и в качестве восстановителя аскорбиновой кислоты. Для очистки наноточек от непрореагировавших компонентов реакционной смеси предложено проводить их центрифугирование в присутствии ацетонитрила с дальнейшим отделением ацетонитрила и редиспергированием наноточек в деионизованой воде. При хранении при 10°С растворы очищенных наноточек стабильны в течение 6 месяцев. Показана возможность люминесцентного определения катехоламинов (дофамина, норадреналина, адреналина) с использованием кремниевых наноточек. Сходные по структуре, но не имеющие катехольного фрагмента вещества (тирамин, фенилэфрин), не взаимодействуют с наноточками аналогично катехоламинам и, соответственно, не мешают их определению. В наибольшей степени взаимодействие наноточек с дофамином происходит при нагревании до 40°С в течение 20 мин, с норадреналином и адреналином – при комнатной температуре в течение 30 мин и 60 мин, соответственно; определение всех катехоламинов следует проводить при рН 10. Пределы обнаружения дофамина, норадреналина и адреналина составили 2, 0.06 и 0.14 мкМ, соответственно, диапазоны определяемых содержаний: 6 – 50 мкМ, 0.20 – 50 мкМ и 0.47 – 50 мкМ. Подтверждена применимость предложенного способа определения катехоламинов для анализа лекарственных препаратов. Показана возможность цветометрического определения катехоламинов с использованием кремниевых наноточек с помощью цифрового фотоаппарата и смартфона. Как источник возбуждения люминесценции рекомендовано использовать ультрафиолетовую лампу с длиной волны излучения 395 нм. При использовании в качестве аналитических сигналов комбинаций цветовых координат R+G+B, евклидово расстояние в системе CMYK и L-a+b пределы обнаружения дофамина, норадреналина и адреналина составляют, соответственно, 0.1, 0.1 и 1 мкМ. На примере норадреналина проведено сравнение люминесцентного и цветометрического определения катехоламинов по реакции с коммерчески доступным реактивом флуорескамином и с синтезированными кремниевыми наноточками. Определение, основанное на использовании кремниевых наноточек, выгодно отличается большей чувствительностью, низкой стоимостью используемых реактивов и соответствием принципам «зелёной химии». Предложенные способы определения применимы для анализа лекарственных препаратов. Продемонстрирована возможность получения люминесцирующих углеродных наноточек средним диаметром 2.7 нм пиролитическим методом из лимонной кислоты. Разбавленный раствор наноточек характеризуется интенсивной люминесценцией при 465 нм при возбуждении люминесценции излучением с длиной волны 365 нм. Полученные наноточки можно применять в качестве люминесцирующих реагентов при определении катехоламинов, пределы обнаружения дофамина, норадреналина и адреналина составили, соответственно, 2, 2 и 8 мкМ. На примере дофамина подтверждена возможность цветометрического определения катехоламинов с использованием углеродных наноточек при комнатном освещении и при облучении ультрафиолетовым диодом (λex = 360 нм). Проведена оптимизация методик синтеза люминесцентных нанокластеров меди с целью их последующего применения для определения биологически активных веществ. Нанокластеры меди можно получать с использованием макромолекулярных полимеров, таких как поли(N-винил-2-пирролидон), либо трипептидов (например, с использованием глутатиона), в роли стабилизаторов. При этом глутатион выполняет одновременно функции стабилизатора нанокластеров и восстановителя, тогда как поли(N-винил-2-пирролидон) требует добавления сильного восстановителя, например, аскорбиновой кислоты. Максимальный выход нанокластеров достигается при десятикратном мольном избытке восстановителя относительно количества сульфата меди(II). Значение рН реакционной смеси существенно влияет на выход нанокластеров меди: оптимальное значение рН раствора составляет 4.0 при использовании аскорбиновой кислоты и 12.0 при применении глутатиона. Выход нанокластеров достигает максимума при проведении синтеза при температуре 75 °C в течение 4 ч; снижение температуры или времени реакции приводит к уменьшению количества образующихся нанокластеров или их полному отсутствию. Синтезированные нанокластеры меди сохраняют агрегативную и седиментационную устойчивость как минимум три месяца при температуре 4 °C. В спектрах возбуждения люминесценции нанокластеров меди наблюдается максимум при длине волны 330 нм, в спектрах люминесценции — при длине волны 425 нм. Разработан экспрессный и селективный способ определения серосодержащих аминокислот с использованием люминесцентных нанокластеров меди. В основе способа лежит ингибирование тушения люминесценции нанокластеров меди при связывании аналита с тушителем посредством сульфгидрильной группы. Концентрацию глутатиона, взаимодействующего с тушителем, определяли по изменению интенсивности люминесценции нанокластеров. Максимальный сигнал наблюдался через 2.5 минуты после смешивания реагентов в диапазоне pH 2–5. Предел обнаружения глутатиона равен 16 мкМ, диапазон определяемых концентраций составляет от 50 мкМ до 0.7 мМ. Относительное стандартное отклонение при определении 0.3 мМ глутатиона не превышало 0.04. Показано, что определению глутатиона не мешают сопоставимые количества глюкозы, фруктозы, таурина, L-орнитина, L-аргинина и янтарной кислоты. Применимость предложенного способа определения глутатиона подтверждена при анализе фармацевтических препаратов, содержащих глутатион в качестве основного компонента. Предложен новый подход к люминесцентному определению L-цистеина, в основе которого лежит селективное взаимодействие этой аминокислоты с ионами меди(II), выступающими в роли эффективных тушителей люминесценции нанокластеров меди. Максимальная интенсивность люминесценции нанокластеров меди при длине волны 420 нм в присутствии 5 мМ раствора сульфата меди(II) достигается при комнатной температуре через 5 мин после добавления 1 мМ раствора L-цистеина в диапазоне pH 7–8. Предел обнаружения L-цистеина в выбранных условиях равен 2 мкМ, диапазон определяемых содержаний составляет 6–1000 мкМ. Апробация разработанной методики проведена при анализе образца фармацевтического препарата «Аминовен Инфант. Раствор для инфузий 10%». Соответствие найденного значения молярной концентрации L-цистеина в препарате с паспортными данными и результатами независимого метода свидетельствует о правильности разработанной методики. Разработан новый люминесцентный способ определения аденозин-5'-трифосфата (АТФ), основанный на изменении интенсивности люминесценции нанокластеров меди в присутствии комплекса «тушитель + АТФ». Максимальная интенсивность люминесценции нанокластеров меди в присутствии тушителя и АТФ достигается через 5 мин после смешивания растворов всех реагентов в диапазоне pH 7–9. Предел обнаружения АТФ при выбранных условиях составляет 10 мкМ, диапазон определяемых содержаний 30–2000 мкМ. Отмечена высокая селективность предложенного способа определения АТФ по отношению к ряду неорганических ионов, характерных для состава биологических жидкостей и природных вод. Предложенный способ определения АТФ применен для анализа фармацевтического препарата «Натрия аденозинтрифосфат. Раствор для внутривенного введения 1 %» и модельных систем, имитирующих состав сточных вод и искусственной мочи. Полученные результаты демонстрируют перспективность нанокластеров меди для разработки высокочувствительных, экспрессных и селективных способов определения биологически активных соединений. Предложенные способы определения отличаются хорошей воспроизводимостью, простотой подготовки проб и совместимостью с компонентами реальных матриц, что делает их пригодными для клинической диагностики, контроля качества лекарственных препаратов и экологического мониторинга. Систематизированы имеющиеся на данный момент литературные сведения о способах получения люминесцентных нанокластеров золота, меди и серебра, их спектральных особенностях и основных стратегиях применения в химическом анализе. Подтверждено, что особой перспективностью обладает создание мультисенсорных аналитических систем на основе нанокластеров с возможностью одновременного детектирования нескольких компонентов. Выявлены основные параметры, влияющие на выделение лекарственных веществ различных классов с использованием шипучих таблеток, состоящих из магнитного нанокомпозита на основе наночастиц магнетита и сверхсшитого полистирола, гидрокарбоната натрия, лимонной кислоты и ЭДТА. Установлено, что при использовании шипучих таблеток, содержащих 0.700 г гидрокарбоната натрия, 0.800 г лимонной кислоты, 0.200 г ЭДТА и 20 мг магнитного сорбента достигаются максимальные степени извлечения большинства из изученных веществ. 2 мл ацетонитрила количественно десорбируют аналиты. На основании проведенных исследований предложен способ выделения плевромутилинов, амфениколов, сульфаниламидов, триметоприма, нитроимидазолов, β-лактамов, хинолонов, макролидов, линкозамидов из речных вод и проведено его сочетание с ВЭЖХ-МС/МС определением. За счет интенсивного выделения углекислого газа при растворении таблетки удается обойтись без использования перемешивающих устройств, а магнитные свойства сорбента позволяют отделить его без применения центрифугирования и фильтрации; в результате процедура выделения занимает менее 3 мин. Способ обеспечивает относительные степени извлечения от 79 до 122 % и хорошую воспроизводимость (относительное стандартное отклонение ≤ 0.12). Матричный эффект для всех лекарственных веществ был ниже 20%. Пределы обнаружения и определения составили 0.012 и 0.04 мкг/л для большинства сульфаниламидов, триметоприма, амфениколов, нитроимидазолов, макролидов, плевромутилинов и линкозамидов и 0.06 и 0.2 мкг/л для β-лактамов и хинолонов, соответственно. Правильность и воспроизводимость методики оценены на трех образцах речной воды из рек Москва, Ока и Вуокса на уровне 0.20 мкг/л. Показано, что наночастицы магнетита способны количественно извлекать тетрациклины (тетрациклин, окситетрациклин, хлортетрациклин и доксициклин) из воды (степени извлечения 97–99%), а также из ацетонитрила, метанола и этилацетата (извлечение составляет 94–100%). Выбраны условия десорбции тетрациклинов с использованием щавелевой кислоты и щелочей, показано, что использование гидроксида натрия или тетраметиламмоний гидроксида позволяет проводить десорбцию при комнатной температуре и сократить время десорбции с 30 до 10 мин. Установлено, что наночастицы позволяют селективно выделять тетрациклины в присутствии таких распространённых классов ветеринарных лекарственных веществ, как сульфаниламиды, нитроимидазолы, амфениколы, нитрофураны. Разработана методика выделения тетрациклинов из меда методом магнитной твердофазной экстракции с последующим ВЭЖХ-МС/МС анализом. Пределы обнаружения составили 1 мкг/кг, что позволяет определять тетрациклины на уровне их максимально допустимых уровней. Методика характеризуется хорошей воспроизводимостью (sr = 0.03–0.16). Правильность определения подтверждена методом введено-найдено. Магнитный сверхсшитый полистирол предложен для выделения сульфаметазина перед его люминесцентным определением по реакции с флуорескамином. Из данных по зависимости сорбции от времени контакта фаз, pH и объема анализируемого раствора найдено, что максимальная сорбция сульфаметазина достигается за 10 мин, при pH раствора 3–5 и при сорбции из растворов объемом 10–50 мл. Максимальная десорбция сульфаметазина достигается при использовании 2 мл 2 %-ного раствора аммиака в ацетонитриле. В оптимальных условиях степень извлечения сульфаметазина составила 100%, а степень десорбции 98 %. Установлено, что ацетонитрил уменьшает интенсивность люминесценции продукта реакции сульфаметазина с флуорескамином, поэтому элюаты упаривали перед анализом и перерастворяли в 1 мл воды. Оценены аналитические характеристики люминесцентного определения аналита после его выделения методом магнитной твердофазной экстракции: предел обнаружения составил 2 нМ, диапазон определяемых содержаний 7–150 нМ. Продемонстрирована возможность экстракционно-флуориметрического определения сульфаниламидных препаратов (сульфаниламида, сульфаметазина, сульфаметоксазола) с использованием бытового цветорегистрирующего устройства – калибратора мониторов. Люминесцирующие производные сульфаниламидов получают в результате предварительной реакции дериватизации с флуорескамином, полученный люминесцирующий продукт экстрагируют в небольшой объем несмешивающегося с водой органического растворителя, плотность которого меньше воды. Калибратор мониторов позволяет проводить определение без отделения экстракта от водной фазы. Экстракция аналитов из 12.5 мл водной фазы в 2.5 мл органической фазы позволяет снизить предел обнаружения сульфаниламида с 0.9 до 0.7 мкМ, сульфаметазина – с 0.8 до 0.4 мкМ, сульфаметоксазола – с 1 до 0.3 мкМ, увеличение соотношения объемов водной и органической фаз приводит к дальнейшему снижению предела обнаружения. Применимость предлагаемого способа определения сульфаниламидов в продуктах питания продемонстрирована при анализе меда.