Разработка новых бимодальных конъюгатов для терапии опухолей предстательной железыНИР

Development of novel bimodal conjugates for prostate cancer therapy

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 29 декабря 2023 г.-31 декабря 2024 г. Разработка новых бимодальных конъюгатов для терапии опухолей предстательной железы
Результаты этапа: Создание низкомолекулярных бимодальных терапевтических конъюгатов предполагает сборку целевых соединений на основе лигандов ПСМА и модифицированных терапевтических агентов. На первом этапе осуществлялся выбор векторной платформы. На данный момент, в литературе представлен обширный набор различных лигандов ПСМА. В качестве базовой модели нами был выбран один из лигандов на основе мочевины DCL, представленный в работе (Zyk N.Y., Garanina A.S., Plotnikova E.A., Ber A.P., Nimenko E.A., Dashkova N.S., Uspenskaia A.A., Shafikov R.R., Skvortsov D.A., Petrov S.A., Pankratov A.A., Zyk N.V., Majouga A.G., Beloglazkina E.K., Machulkin A.E. Synthesis of Prostate-Specific Membrane Antigen-Targeted Bimodal Conjugates of Cytotoxic Agents and Antiandrogens and Their Comparative Assessment with Monoconjugates // International Journal of Molecular Sciences, 2023, 24 (14), DOI: 10.3390/ijms241411327). Из представленных в публикации структурных мотивов было выбрано соединение, содержащее в своей структуре m-Cl-бензильный фрагмент при ε-аминогруппе лизина мочевинного фрагмента и остаток L-тирозина в пептидном фрагменте линкера. С одной стороны данный выбор обоснован наличием широкого спектра примеров терапевтических конъюгатов на основе аналога данного соединения без остатка лизина в структуре линкера (Machulkin A.E., Uspenskaya A.A., Zyk N.Y., Nimenko E.A., Ber A.P., Petrov S.A., Shafikov R.R., Skvortsov D.A., Smirnova G.B., Borisova Y.A., Pokrovsky V.S., Kolmogorov V.S., Vaneev A.N., Ivanenkov Y.A., Khudyakov A.D., Kovalev S.V., Erofeev A.S., Gorelkin P.V., Beloglazkina E.K., Zyk N.V., Khazanova E.S., Majouga A.G. PSMA-targeted small-molecule docetaxel conjugate: Synthesis and preclinical evaluation // European Journal of Medicinal Chemistry, 2022, 227, DOI: 10.1016/j.ejmech.2021.113936; Machulkin A.E., Uspenskaya A.A., Zyk N.U., Nimenko E.A., Ber A.P., Petrov S.A., Polshakov V.I., Shafikov R.R., Skvortsov D.A., Plotnikova E.A., Pankratov A.A., Smirnova G.B., Borisova Y.A., Pokrovsky V.S., Kolmogorov V.S., Vaneev A.N., Khudyakov A.D., Chepikova O.E., Kovalev S.V., Zamyatnin A.A., Erofeev A.S., Gorelkin P.V., Beloglazkina E.K., Zyk N.V., Khazanova E.S., Majouga A.G. Synthesis, characterization and preclinical evaluation of small-molecule prostate-specific membrane antigen targeted monomethyl auristatin E conjugate // Journal of Medicinal Chemistry, 2021, 64 (23), DOI: 10.1021/acs.jmedchem.1c01157). С другой стороны, в рамках упомянутой работы 2023 года авторами были синтезированы бимодальные конъюгаты на основе данного лигнада, которые были исследованы in vivo на ксенографтных моделях опухолей предстательной железы и продемонстрировали эффективность торможения роста опухоли, сопоставимую с моноконъюгатом, содержащим препарат монометил ауристатин Е. Для получения выбранной векторной платформы на первом этапе был осуществлён синтез защищённого векторного фрагмента с алифатическим фрагментом линкера исходя из три-трет-бутил защищённой мочевины DCL в соответствии с методиками, предложенными в литературе (Machulkin A.E., Shafikov R.R., Uspenskaya A.A., Petrov S.A., Ber A.P., Skvortsov D.A., Nimenko E.A., Zyk N.U., Smirnova G.B., Pokrovsky V.S., Abakumov M.A., Saltykova I.V., Akhmirov R.T., Garanina A.S., Polshakov V.I., Saveliev O.Y., Ivanenkov Y.A., Aladinskaya A.V., Finko A.V., Yamansarov E.U., Krasnovskaya O.O., Erofeev A.S., Gorelkin P.V., Dontsova O.A., Beloglazkina E.K., Zyk N.V., Khazanova E.S., Majouga A.G. Synthesis and Biological Evaluation of PSMA Ligands with Aromatic Residues and Fluorescent Conjugates Based on Them // Journal of Medicinal Chemistry, 2021, 64 (8), DOI: 10.1021/acs.jmedchem.0c01935). На первой стадии проводилась реакция восстановительного аминирования, в которую были введены исходная защищённая мочевина и 3-хлорбензальдегид. Полученный вторичный амин был введён в реакцию ацилирования с 6-азидогексановой кислотой. Терминальная азидогруппа полученного продукта была в дальнейшем восстановлена трифенилфосфином, после чего синтезированный таким образом амин был проацилирован янтарным ангидридом. Следующим этапом стало получение пептидного фрагмента линкера с применением твердофазного синтеза. На первом этапе осуществлялась иммобилизация на твердофазном носителе остатка лизина, Fmoc-защищённого по α-аминогруппе и Boc-защищённого по ε-аминогруппе. В дальнейшем проводилось удаление Fmoc-защитной группы и ацилирование свободной аминофункции остатком тирозина. Аналогичным путём в структуру линкера был введён остаток фенилаланина. Для получения целевого лиганда полученная трипептидная последовательность была введена в реакцию ацилирования на твердофазном носителе с полученным векторным фрагментом, полученное соединение было удалено со смолы и введено в реакцию ацилирования с азидопропиламином. На последнем этапе осуществлялось удаление защитных групп с получением целевого лиганда ПСМА, пригодного для создания на его основе бимодальных конъюгатов. Следующим шагом, стало получение на основе данного лиганда новых ингибиторов ПСМА, содержащих в своей структуре две азидогруппы. Для этого были получены NHS-эфиры азидоуксусной и 6-азидогексановой кислот. В дальнейшем данные соединения были введены в реакцию ацилирования с полученным на предыдущем этапе лигандом. В рамках данного этапа работы была осуществлена оптимизация условий выделения целевых соединений. Изначально, целевые диазиды предполагалось выделять путём высаживания после удаления при пониженном давлении диметилформамида, в котором проводилась реакция ацилирования. Однако, в обоих случаях выделить целевые продукты высаживанием диэтиловым эфиром, хлористым метиленом или ацетонитрилом не удалось. В связи с этим было принято решение осуществлять выделение целевых соединений путём обращённо-фазовой препаративной колоночной хроматографии. Таким образом удалось выделить целевые лиганды в индивидуальном виде. На следующем этапе проводился отбор потенциальных комбинаций терапевтических агентов на основе литературных данных. В качестве одного из препаратов нами был выбран монометил ауристатин Е, в связи с тем, что мономодальный конъюгат на его основе показал достаточно высокую эффективность в экспериментах in vivo (Machulkin A.E., Uspenskaya A.A., Zyk N.U., Nimenko E.A., Ber A.P., Petrov S.A., Polshakov V.I., Shafikov R.R., Skvortsov D.A., Plotnikova E.A., Pankratov A.A., Smirnova G.B., Borisova Y.A., Pokrovsky V.S., Kolmogorov V.S., Vaneev A.N., Khudyakov A.D., Chepikova O.E., Kovalev S.V., Zamyatnin A.A., Erofeev A.S., Gorelkin P.V., Beloglazkina E.K., Zyk N.V., Khazanova E.S., Majouga A.G. Synthesis, characterization and preclinical evaluation of small-molecule prostate-specific membrane antigen targeted monomethyl auristatin E conjugate // Journal of Medicinal Chemistry, 2021, 64 (23), DOI: 10.1021/acs.jmedchem.1c01157). Также, в литературе представлены бимодальные терапевтические конъюгаты на его основе, содержащие в качестве второго агента препараты абиратерон и энзалутамид (Zyk N.Y., Garanina A.S., Plotnikova E.A., Ber A.P., Nimenko E.A., Dashkova N.S., Uspenskaia A.A., Shafikov R.R., Skvortsov D.A., Petrov S.A., Pankratov A.A., Zyk N.V., Majouga A.G., Beloglazkina E.K., Machulkin A.E. Synthesis of Prostate-Specific Membrane Antigen-Targeted Bimodal Conjugates of Cytotoxic Agents and Antiandrogens and Their Comparative Assessment with Monoconjugates // International Journal of Molecular Sciences, 2023, 24 (14), DOI: 10.3390/ijms241411327). Механизм терапевтического действия ММАЕ – ингибирование полимеризации тубулина. В качестве препаратов, которые могут быть использованы в комбинации с ММАЕ нами предполагается следующий набор: 1. Испинесиб (ингибитор кинезина 5). Ранее в литературе был представлен набор исследований по использованию данного соединения в комбинации с ингибитором деполимеризации тубулина (S P Blagden, L R Molife, A Seebaran, M Payne, A H M Reid, A S Protheroe, L S Vasist, D D Williams, C Bowen, S J Kathman, J P Hodge, M M Dar, J S de Bono, M R Middleton, A phase I trial of ispinesib, a kinesin spindle protein inhibitor, with docetaxel in patients with advanced solid tumours // British Journal of Cancer, 2008, 98, DOI: 10.1038/sj.bjc.6604264). Также есть данные по использованию его в комбинации с другими терапевтическими агентами, такими как лапатиниб, доксорубицин, иксабепилон и другие (J.W. Purcell; J. Davis; M. Reddy; S. Martin; K. Samayoa; H. Vo; K. Thomsen; P. Bean; W.L. Kuo; S. Ziyad; J. Billig; H.S. Feiler; J.W. Gray; K.W. Wood; S. Cases, Activity of the Kinesin Spindle Protein Inhibitor Ispinesib (SB-715992) in Models of Breast Cancer // Clin. Cancer Res., 2010, 16 (2), DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-09-1498). 2. Рукапариб (PARP-ингибитор). Также как и испинесиб для данного препарата имеются данные по его эффективности в комбинации с ингибиторами тубулина (конкретно, с паклитакселом) (J. Gao, Z. Wang, J. Fu, Jisaihan A., Y. Ohno, C. Xu, Combination treatment with cisplatin, paclitaxel and olaparib has synergistic and dose reduction potential in ovarian cancer cells // EXPERIMENTAL AND THERAPEUTIC MEDICINE, 2021, 22 (3), DOI: 10.3892/etm.2021.10367). Также есть данные по использованию в комбинации других PARP-ингибиторов, таких как олапариб и талазопариб. Выбор именно данного ингибитора поли-(АДФ‐рибоза)-полимеразы обоснован его структурой. В отличии от олапариба и талазопариба в структуре рукапариба присутствует вторичный амин, который может быть подвергнут модификации для последующего конъюгирования с вектор-молекулой. 3. Бупарлисиб (PI3K ингибитор). Для PI3K ингибиторов есть данные о проведении клинических исследований в комбинации с монометил ауристатином Е (ММАЕ в форме конъюгата с антителом, номер клинического исследования NCT02164006). Выбор именного этого ингибитора обоснован синтетической возможностью его модификации за счёт наличия в структуре аминогруппы, а также тем, что для бупарлисиба имеются данные по применению его в комбинации с PARP-ингибитором талазапарибом (M.J. Neufeld, AN. DuRoss, M.R. Landry, H. Winter, A.M. Goforth, C. Sun, Co-delivery of PARP and PI3K inhibitors by nanoscale metal–organic frameworks for enhanced tumor chemoradiation // Nano Research, 2019, 12, DOI: 10.1007/s12274-019-2544-z). Также, нами рассматриваются некоторые другие пары терапевтических агентов, такие как ММАЕ/Комбретастатин А4 (его аминосодержащий аналог), доксорубицин/ресвератрол. На следующем этапе работы была проведен подбор условий модификации выбранных терапевтических агентов. Модификацию ММАЕ осуществляли путём введения катепсин-расщепляемого линкера в структуру агента в соответствии с литературными методиками (Machulkin A.E., Uspenskaya A.A., Zyk N.U., Nimenko E.A., Ber A.P., Petrov S.A., Polshakov V.I., Shafikov R.R., Skvortsov D.A., Plotnikova E.A., Pankratov A.A., Smirnova G.B., Borisova Y.A., Pokrovsky V.S., Kolmogorov V.S., Vaneev A.N., Khudyakov A.D., Chepikova O.E., Kovalev S.V., Zamyatnin A.A., Erofeev A.S., Gorelkin P.V., Beloglazkina E.K., Zyk N.V., Khazanova E.S., Majouga A.G. Synthesis, characterization and preclinical evaluation of small-molecule prostate-specific membrane antigen targeted monomethyl auristatin E conjugate // Journal of Medicinal Chemistry, 2021, 64 (23), DOI: 10.1021/acs.jmedchem.1c01157). Для препаратов, которые предполагается использовать в комбинации с ним было предложено два варианта модификации. Первым вариант модификации был реализован на препарате испинесиб. В рамках этого варианта на первой стадии проводилась реакция ацилирования аминогруппы испинесиба янтарным ангидридом, затем, полученную кислоту вводили в реакцию получения NHS-активированного эфира. Полученный таким образом модифицированный препарат в дальнейшем мог быть введён в реакцию конъюгирования с лигандом путём ацилирования атома азота остатка лизина в структуре линкера. Второй вариант модификации предполагал введение ферментативно-расщепляемого линкера в структуру терапевтического агента по аналогии с модификацией ММАЕ. Линкер был выбран такой же, как и в случае ММАЕ. Данная модификация позволяет осуществить конъюгирование с лигандом за счёт реакции азид-алкинового циклоприсоединения, катализируемого ионами меди. Подобным образом была проведена модификация аминосодержащего аналога Комбретастатина А4 и рукапариба. Все полученные соединения были охарактеризованы методами ЯМР-спектроскопии, масс-спектрометрии высокого разрешения, а чистота соединений, которые планируется исследовать в экспериментах in vitro была подтверждена методом ВЭЖХ-МС. Также, в рамках текущего отчётного периода был осуществлён синтез бимодального конъюгата лиганда ПСМА с терапевтическими агентами испинесиб и ММАЕ. Для получения данного бимодального конъюгата было проведена реакция азид-алкинового циклоприсоединения модифицированного ММАЕ с лигандом ПСМА, полученный мономодальный конъюгат в дальнейшем был введён в реакцию ацилирования с модифицированным испинесибом. Проведены in vitro исследования цитотоксичности как свободных препаратов (индивидуально и в эквимолярной смеси), так и конечного конъюгата. В рамках проведённой работы удалось достичь следующих научных результатов. Осуществлён синтез лиганда ПСМА на основе мочевины DCL. Исходя из этого соединения были получены два ранее не описанных лиганда ПСМА, содержащих в структуре две азидогруппы и отличающиеся длиной алкильной цепи. Оптимизированы условия выделения данных соединений, полученные лиганды охарактеризованы методом ЯМР-спектроскопии. Осуществлён анализ литературных источников, на основании данного анализа был подобран набор терапевтических агентов, которые могут быть использованы для получения целевых бимодальных терапевтических конъюгатов. Составлен набор комбинаций для дальнейшего исследования в экспериментах in vitro. Проведён подбор вариантов модификации выбранных терапевтических агентов и предложено два синтетических маршрута для получения целевых бимодальных конъюгатов. Исходя из этих вариантов был осуществлён синтез модифицированного препарата испинесиб для конъюгирования с применением реакции ацилирования. Проведена модификация препарата рукапариб и аминосодержащего аналога комбретастатина А4 катепсин-расщепляемым линкером, содержащим в своей структуре терминальную тройную связь, для последующего конъюгирования с лигандом путём реакции азид-алкинового циклоприсоединения. Полученные таким образом соединения были охарактеризованы методами ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии высокого разрешения. Проведены in vitro исследования комбинации препаратов испинесиб и монометил ауристатин Е на четырёх клеточных линиях. Показано отсутствие антагонизма между препаратами на опухолевых клеточных моделях путём расчёта комбинационного индекса по уравнению Чоу-Талалея. Был получен ранее не описанный бимодальный конъюгат лиганда ПСМА, содержащий в своей структуре, терапевтические агенты испинесиб и ММАЕ. Данный конъюгат был получен путём последовательного проведения реакции азид-алкинового циклоприсоединения модифицированного ММАЕ и ацилирования продукта этой реакции модифицированным испинесибом. Проведены in vitro исследования цитотоксичности данного соединения на клеточных моделях рака предстательной железы с различной экспрессией ПСМА. Показано наличие селективности исследуемого препарата к высокоэкспрессирующим моделям. По итогу, было получено два ранее не описанных лиганда ПСМА, три модифицированных формы терапевтических агентов и один новый бимодальный конъюгат. Конъюгат был охарактеризован комплексом физико-химических методов анализа и протестирован in vitro. Результаты проделанной работы были опубликованы в следующих статьях: 1. A novel molecular platform for co-delivery of monomethyl auristatin E and ispinesib to prostate cancer cells / N.Yu. Zyk, A.Yu. Kolchanova, N.S. Volkova, A.A. Uspenskaia, D.A. Skvortsov, E.K. Beloglazkina, N.V. Zyk, A.G. Majouga and A.E. Machulkin / Mendeleev Communications, 2025.
2 1 января 2025 г.-31 декабря 2025 г. Разработка новых бимодальных конъюгатов для терапии опухолей предстательной железы
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".