Разработка люминесцентных углеродных наноточек для направленной доставки фотосенсибилизаторовНИР

Development of luminescent carbon nanodots for targeted delivery of photosensitizers

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. Разработка люминесцентных углеродных наноточек для направленной доставки фотосенсибилизаторов
Результаты этапа: В течение первого года выполнения проекта были синтезированы углеродные наноточки (НТ) на основе водного раствора сахарозы с различными дополнительными органическими веществами (глицин, цитрат натрия, мочевина, хлорид аммония, неорганические фосфаты, сульфат аммония, динатриевая соль ЭДТА, аланин, аргинин и др.), модифицирующими структурные и фотофизические свойства получаемых наночастиц. Наноточки синтезировали в мини-реакторах гидротермального синтеза объемом 25 мл при температурах 180 – 230 °С в течение 1 – 3 часов. Для дальнейшего анализа коллоидный раствор НТ подвергали процедурам очистки от низкомолекулярных компонентов (диализ, 7 кДа) и минорной фракции крупных агрегатов (фильтрация, 200 нм); разделение образцов НТ методом ультрацентрифугирования в градиенте сахарозы (2-5%) позволило получить фракции НТ с минимальным распределением по размерам (2-3 нм). Структурные свойства полученных НТ исследовали методами динамического светорассеяния, просвечивающей электронной микроскопии и Фурье-ИК спектроскопии. Было показано, что НТ представляют аморфную фазу углерода без кристаллической структуры, имеют квазисферическую форму. Размер полученных наночастиц зависит от условий синтеза (температура, время) и особенностей подбора исходных реагентов (тип реагентов, их молярное соотношение и общая концентрация). Регистрация спектров поглощения высушенных образцов наночастиц в средней инфракрасной области спектра позволила установить наличие кислородсодержащих полярных функциональных групп на поверхности наночастиц, двойных С=С связей и ряд полос, соответствующих органическим соединениям азота, серы и фосфора (при их наличии среди прекурсоров для синтеза НТ). Была произведена оценка воспроизводимости спектральных и структурных свойств наночастиц с целью изучения возможностей и перспектив масштабирования гидротермального синтеза. Независимо были синтезированы 12 образцов наночастиц из смеси сахарозы и цитрата натрия в эквимолярном соотношении при температуре 200°С в течение 1 ч с последующими стандартными процедурами очистки. Методами математической статистики была доказана прекрасная воспроизводимость состава их поверхности НТ, удовлетворительная воспроизводимость размера и формы наночастиц, положения и формы спектров их флуоресценции и возбуждения флуоресценции, величины длительности флуоресценции и ее квантового выхода. Показано, что все наночастицы гидротермального синтеза на основе сахарозы обладают флуоресценцией в области 450-600 нм, причем встраивание гетероатомов сильно модифицирует флуоресцентные свойства наночастиц, сдвигая спектры в длинноволновую область и увеличивая квантовый выход флуоресценции, приближающийся к 20%. Спектры возбуждения флуоресценции наночастиц имеют один максимум в видимой синей области спектра и ряд полос в ближней УФ области. Кинетики затухания флуоресценции наночастиц имеют несколько временных компонент, хорошо описываются в триэкспоненциальном приближении. Фотофизическая гетерогенность наночастиц объясняется наличием большого набора флуоресцирующих центров на поверхности наночастиц, имеющих различный атомарный состав. Анализ выживаемости клеток в присутствии наночастиц в тесте МТТ показал отсутствие какого-либо влияния последних на клетки в культурах HEK293, HeLa, Wi38, A431 в концентрациях наночастиц до 1 мг/мл при темновой и световой инкубации в серии экспериментов с длительностями до 12 часов. В некоторых случаях наблюдалась усиленная клеточная пролиферация в присутствии наночастиц, которую можно объяснить биодоступностью некоторых вариантов полученных НТ как пищевого ресурса. Значительной цитотоксичности не выявлено во всех 18 типах полученных наночастиц. Методами конфокальной флуоресцентной микроскопии (CLSM) и микроскопии с временным разрешением (FLIM) продемонстрирована флуоресценция НТ внутри клеток. Локализация наночастиц отмечается в лизосомах и цитоплазме. Рассматривается клатрин-опосредованный эндоцитоз как наиболее вероятный механизм проникновения углеродных НТ в клетки. В рамках подготовки к следующему году выполнения проекта завершена работа по созданию осветительной установки для изучения фотодинамических свойств фотосенсибилизаторов и гибридных конъюгатов с наночастицами на их основе. В результате расчетов и ряда инженерных решений представлена конструкция, позволяющая проводить равномерное освещение для культуральных планшетов (в вариантах 12/24/96 лунок), что позволит получать результаты фотодинамической активности конъюгатов с большой точностью и воспроизводимостью.
2 1 января 2025 г.-31 декабря 2025 г. Разработка люминесцентных углеродных наноточек для направленной доставки фотосенсибилизаторов
Результаты этапа: Второй этап реализации проекта был посвящен использованию углеродных наноточек (НТ), синтезированных и охарактеризованных на предыдущей стадии, в качестве платформенных носителей для направленной доставки молекул фотосенсибилизаторов в клеточные линии опухолевого происхождения. Конъюгаты на основе НТ, полученных методом гидротермального синтеза, и фотосенсибилизаторов — водорастворимых заряженных металлокомплексов фталоцианина (Фц) — формировали посредством самосборки в фосфатно-солевом буфере (PBS). Первичным механизмом являлась электростатическая адсорбция поликатионных Фц на отрицательно заряженную поверхность НТ. Детальный анализ спектральных и фотофизических характеристик Фц в составе конъюгата проводили методами абсорбционной спектроскопии, стационарной и время-разрешенной флуориметрии. Полученные данные свидетельствуют о сохранении способности молекул Фц в составе конъюгата к переходу в возбужденное состояние под действием света в красной области спектра с последующей флуоресценцией и генерацией синглетного кислорода. Фотоиндуцированное образование синглетного кислорода конъюгатами Фц-НТ было подтверждено методом химических ловушек с использованием ADMA, TMAPA, а также системы ImH-RNO, адаптированной в рамках настоящего исследования для изучения свойств металлокомплексов Фц. Вторичный механизм взаимодействия между Фц и НТ обусловлен эффектом π-π-стекинга, возникающим при перекрывании электронных систем ароматического макроцикла Фц и sp²-гибридизированных углеродных доменов на поверхности НТ. Наличие подобных доменов на синтезированных нами НТ было подтверждено методами комбинационного рассеяния и XPS. Формирование данного типа связи сопровождается батохромным сдвигом полосы поглощения Фц, гипохромным эффектом и статическим тушением флуоресценции. Кинетика тушения хорошо описывается в рамках модели Штерна-Фольмера для случая адсорбции нескольких молекул Фц на одну наночастицу. π-π-стекинг наблюдается и в системах, где оба компонента несут одноименный заряд, хотя стехиометрия таких конъюгатов Фц:НТ не превышает 2:1. Установлено, что в конъюгатах НТ с поликатионными производными Фц цинка и алюминия реализуются оба описанных механизма. Для алюминиевых Фц было зафиксировано значительное снижение эффективности π-π-стекинга по сравнению с цинковыми Фц. Данный эффект объясняется наличием аксиального гидроксильного лиганда у центрального атома алюминия, создающего стерические препятствия для эффективного π-π-взаимодействия. В процессе конъюгации образование димеров Фц или агрегатов более высокого порядка не наблюдалось, что является критически важным, поскольку ассоциация Фц по Н-типу существенно снижает эффективность фотодинамического воздействия. Комбинированное применение спектральных методов и ультрацентрифугирования позволило количественно оценить сорбционную ёмкость НТ. Установлено, что одна НТ способна сорбировать порядка 15 молекул поликатионных производных Фц. Адсорбция Фц приводит к повышению квантового выхода флуоресценции НТ более чем в 1.5 раза. Поликатионные Фц в составе конъюгата сохраняют фотосенсибилизирующую активность, демонстрируя выход генерации синглетного кислорода на уровне ~20%. Исследование показало существенное влияние стехиометрии на коллоидную стабильность образующихся конъюгатов. Сравнительный анализ проводился для систем на основе НТ и наноалмазов детонационного синтеза с поликатионными Фц. Установлено, что процесс адсорбции сопровождается компенсацией отрицательного поверхностного заряда наночастиц (обусловленного присутствием ионизированных карбоксильных групп -COO⁻) положительно заряженными периферическими заместителями молекул Фц. Обнаружено существование критической локальной концентрации Фц, приводящей к практически полной нейтрализации поверхности углеродных наночастиц (дзета-потенциал ≤ |5| мВ). В этой точке наблюдается коллапс коллоидной системы, сопровождающийся коагуляцией и резким увеличением гидродинамического диаметра конъюгатов до ~1 мкм. В случае, когда сорбционная емкость наночастиц превышает указанную критическую концентрацию, система стабилизируется за счет инверсии поверхностного заряда и формирования положительного дзета-потенциала (размеры конъюгатов составляют 20-50 нм). На заключительном этапе исследования была изучена клеточная интернализация конъюгатов Фц-НТ и их фотодинамическая активность на модели эпидермоидной карциномы человека линии A431 in vitro. Инкубация клеток с конъюгатом ZnФц(+8)-НТ (мольное соотношение 8:1, конечная концентрация Фц 0.5 мкМ) в течение 30–60 минут приводила к появлению флуоресцентного сигнала Фц в двух клеточных компартментах, в области плазматической мембраны и перинуклеарной области. С помощью конфокальной микроскопии и коммерческих органелло-специфичных зондов (LumiTracker® Lyso Red, Mito Red FM, ER Red) была установлена субклеточная локализация НТ. Основная доля флуоресценции НТ (500–600 нм) ко-локализовалась с лизосомальными маркерами. Более слабый сигнал также регистрировался в митохондриях и эндоплазматическом ретикулуме. Подтверждена ко-локализация флуоресцентных сигналов от Фц и НТ в лизосомах, что свидетельствует о совместной интернализации компонентов конъюгата. Фотодинамическая эффективность конъюгатов была оценена с помощью МТТ-теста. Показано, что гибель клеток линии A431 достоверно коррелирует со способностью иммобилизованных на НТ фталоцианинов генерировать синглетный кислород. При облучении (λ = 660 нм, мощность плотности потока 76 мВт/см², время экспозиции 3 минуты) конъюгаты демонстрировали выраженный цитотоксический эффект, сопоставимый по эффективности со свободными молекулами Фц. Таким образом, полученные данные подтверждают, что молекулы Фц сохраняют функциональную активность в составе конъюгата с уНТ. Результаты обосновывают перспективность разработанной платформы на основе НТ гидротермального синтеза для направленной доставки фотосенсибилизаторов в стратегиях фотодинамической терапии.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".