ИСТИНА

Структурно-функциональный анализ белково-нуклеиновых комплексов как основа для создания синтетических регуляторов экспрессии генов и лекарственных препаратов нового поколения. Определение алгоритма специфических белково-нуклеиновых взаимодействий в супрамолекулярных комплексах биополимеров, в том числе и в процессе их реорганизации. Выяснение молекулярного механизма и регуляции ключевых биологических процессов, таких как синтез и модификация биополимеров, интеграция вирусных ДНК в геном человека, репарация геномных повреждений основные направления исследований - дизайн, синтез и использование новых типов олигонуклеотидных реагентов, нацеленных на ключевые регуляторные белки и ферменты живой клетки для активного влияния на клеточные процессы; изучение молекулярных основ узнавания и взаимодействия нуклеиновых кислот с белками, ответственными за биосинтез и модификацию биополимеров, интеграцию вирусной ДНК в клеточный геном, контроль экспрессии генов; выбор перспективных белков-мишеней для создания модуляторов их активности на основе модифицированных олигонуклеотидов - прототипов новых лекарственных средств; создание ДНК-биосенсоров нового типа для выявления точечных мутаций генетического материала, играющих критическую роль в развитии генетических заболеваний и процессах злокачественного перерождения клеток.

Structural and functional analysis of protein-nucleic complexes as a basis for creating synthetic regulators of gene expression and new generation drugs. Determination of the algorithm of specific protein-nucleic interactions in supramolecular complexes of biopolymers, including in the process of their reorganization. Clarification of the molecular mechanism and regulation of key biological processes, such as the synthesis and modification of biopolymers, the integration of viral DNA into the human genome, the repair of genomic damage The main areas of research - design, synthesis and use of new types of oligonucleotide reagents aimed at key regulatory proteins and enzymes of living cells for an active influence on cellular processes; study of the molecular basis for the recognition and interaction of nucleic acids with proteins responsible for the biosynthesis and modification of biopolymers, the integration of viral DNA into the cellular genome, control of gene expression; selection of promising target proteins for creating modulators of their activity based on modified oligonucleotides - prototypes of new drugs; the creation of a new type of DNA biosensors to detect point mutations of genetic material that play a critical role in the development of genetic diseases and the processes of malignant transformation of cells.

В рамках исследования свойств и функций малых некодирующих РНК впервые будет показано, что 6S-1 и 6S-2 РНК Bacillus subtilis способны специфически ингибировать in vitro транскрипцию модельных промоторов различных генов B. subtilis. Необходимо установить, как обе 6S РНК проявляют сравнимую эффективность ингибирования транскрипции вне зависимости от нуклеотидных последовательностей промоторных элементов выбранных генов и природы стартового нуклеотида, а также продемонстрировать in vitro синтез коротких фрагментов РНК (пРНК) на 6S-1 и 6S-2 РНК B. subtilis в качестве матриц для транскрипции и определить их нуклеотидные последовательности. Методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) будет изучена морфология агрегатов, образуемых сигма70-субъединицей РНК-полимеразы E.coli и ее мутантными вариантами в различных условиях, при варьировании ионной силы и рН раствора, а также в присутствии различных низкомолекулярных лигандов. Обнаруженный полиморфизм агрегатов позволит предложить новую универсальную модель формирования амилоидных фибрилл. Методом молекулярного клонирования и сайт-специфического мутагенеза в комбинации с аффинной хроматографией получен рекомбинантный белок ядерного экспорта вируса гриппа (NEP), а также ряд мутантных вариантов белка с заменами остатка триптофана 78, предположительно участвующего во взаимодействии с белком оболочки вируса М1. Будет продемонстрирована высокая способность белка к агрегации. Методами светорассеяния и атомно-силовой микроскопии будет изучена морфология образующихся агрегатов, представляющих собой в основном сферические макрочастицы и мсследовано влияние различных факторов (ионной силы, концентрации белка, присутствие различных низкомолекулярных лигандов) на характер агрегации.

Научный коллектив в течение многих лет разрабатывает методы автоматического синтеза модифицированных фрагментов ДНК и их использования для получения конъюгатов различной структуры, а также аффинной модификации белков. Эти соединения зарекомендовали себя как уникальные инструменты исследования белково-нуклеиновых взаимодействий и модуляторы активности НК-связывающих белков. Синтез таких ДНК-лигандов является приоритетной разработкой научной группы и не имеет аналогов в мире. Были сконструированы и получены новые классы олигонуклеотидов с химически активными группами с помощью специально разработанной стратегии гибкого варьирования типа и позиции модификации в углеводофосфатном остове ДНК. У членов научного коллектива имеется большой опыт работы с серусодержащими производными олигонуклеотидов. Достижением последнего времени являются результаты, полученные при изучении начальных этапов системы репарации неканонических пар нуклеотидов в E. coli сочетанием метода ковалентной фиксации образующихся промежуточных комплексов с регистрацией FRET. На примере окислительного повреждения тимидина - тимидингликоля разработана пошаговая последовательность операций, результаты выполнения которых позволяют сделать вывод о возможности репарации повреждения системой MMR. Члены научного коллектива являются высококвалифицированными специалистами в области исследования физико-химических свойств и тонкой структуры различных форм ДНК. Предложен подход, который может быть использован для оптимизации реакции изотермической амплификации ДНК с вытеснением цепи, а также для модулирования активности химерных нуклеаз, применяемых в генной терапии.

В рамках разработки новых ингибиторов репликации вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) проводится изучение молекулярных и структурных особенностей взаимодействия интегразы вирусной (ИН) и клеточного белка Ku70. Предполагается, что взаимодействие Ku70с ИН важно для эффективной репликации ВИЧ-1, поэтому комплекс этого клеточного белка с вирусной ИН может рассматриваться в качестве новой мишени для создания противовирусных препаратов. Установлено, что Ku70 связывается с ИН ВИЧ-1; причем это взаимодействие специфично, поскольку с ИН другого ретровируса (PFV) Ku70 не связывается. С помощью специально полученных делеционных мутантов обоих белков показано, что N-концевой домен Ku70 связывается с каталитическим доменом ИН в районе аминокислот 160-220. Взаимодействие С-концевого домена Ku70 с интегразой происходит в районе аминокислот 50-160. Более детальное изучение участков связывания будет продолжено. Методом сайт-специфического мутагенеза в комбинации с аффинной хроматографией получен ряд мутантных вариантов белка Е2 (одного из основных компонентов вириона вируса гепатита C) с заменами аминокислотных остатков в сайтах N-гликозилирования. Исследование влияния произведенных замен на взаимодействие Е2 с белком Е1 в бакуловирусной системе позволило выявить ключевые сайты, участвующие в образовании функционального гетеродимерного комплекса Е1-Е2, обеспечивающего полноценную сборку вирусной частицы. С целью изучения механизмов агрегации белков методами генной инженерии получен набор плазмидных конструкций, позволивших экспрессировать и выделить в чистом виде ряд мутантных вариантов белка ядерного экспорта вируса гриппа (NEP), в том числе составных белков, содержащих флуоресцентные компоненты. Исследование методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) морфологии агрегатов, формируемых некоторыми рекомбинантными белками, позволило предложить усовершенствованную модель формирования амилоидных фибрилл.