ИСТИНА

Преэклампсия (ПЭ) является серьезным гестационным осложнением, характеризуемым гипертензией, протеинурией и полиорганной недостаточностью. ПЭ является основной причиной материнской и перинатальной заболеваемости и смертности во всем мире. Тем не менее, этиология ПЭ до сих пор остается неясной. Наше исследование было проведено на плаценте и включало 38 пациентов: 14 с неосложненной беременностью; 13 с ранней ПЭ (рПЭ); и 11 с поздней ПЭ (пПЭ). Нами был проведен анализ иммунофенотипа клеток, выделенных из плаценты: все образцы биопсии были позитивно окрашено антителами на цитокератин 7, Sox2, Nestin, Vimentin и CD44. В ходе выполнения проекта в лаборатории митохондриальной медицины проводилось комплексное исследование уровня относительной экспрессии генов-участников различных сигнальных каскадов, которые могут быть вовлечены в развитие патологии прекэлампсии. Изучение генов интереса проводилось в биопсийных образцах плаценты от женщин контрольной группы и групп ранней и поздней преклампсии методом Вестерн-блота и ПЦР в реальном времени. Мы получили значимое увеличение уровня мРНК гена и продукции белка OPA1 в плацентепри рПЭ. Кроме того, наблюдалось снижение экспрессии белка TFAM по сравнению с контрольной группой (р <0,01). Число копий митохондриальной ДНК в плацентах при рПЭ была значимо выше, чем в образцах плаценты от нормальной беременности. Мы наблюдали увеличение максимального сопряженного дыхания в плацентарных митохондриях в присутствии субстратов I дыхательного комплекса в группе рПЭ и увеличение коэффициента эффективности окислительного фосфорилирования (P/O), активности цитрат-синтазы и снижение Са2 + индуцированной скорости деполяризации митохондрий в обеих группах ПЭ. Наши результаты свидетельствуют о существенном вкладе митохондриальной активности в адаптивный ответ на развитие ПЭ. Баланс между слиянием и фрагментацией митохондрий позволяет клетке адаптироваться к изменениям внешних условий, таким как гипоксия и условия окислительного стресса. Т.к. данные изменения могут служить свидетельством нарушений эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) в клетках трофобласта при преэклампсии, дальнейшей задачей явилось выяснение сигнального каскада, отвечающего за реализацию данного процесса. В настоящее время особый интерес представляет Wnt-путь. Поэтому проводилась оценка уровня относительной экспрессии маркеров ЭМП – участников сигнального пути Wnt: N-, E-кадгеринов, Vimentin (методом Вестерн-блот), генов SNAI1, beta-катенина и GSK3beta (методом ПЦР в реальном времени с реакцией обратной транскрипции). Уровень относительной экспрессии маркера мезенхимальных клеток белка Vimentin (белка промежуточных филаментов) не различался между группами. Экспрессия E- и N-кадгеринов, обеспечивающих клеточную адгезию и межклеточные контакты, так же не изменялась при ранней и поздней преэклампсии. Важнейшими участниками канонического Wnt-сигнального пути являются белки beta-катенин и белок GSK3beta. Уровень относительной экспрессии этих генов также не отличался в исследуемых группах. Не изменялась также относительная экспрессия гена транскрипционного фактора SNAI1, способного супрессировать экспрессию E-кадгерина. На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что функционирование сигнального каскада с участием Wnt не изменяется при ранней и поздней преэклампсии, однако ЭМП в клетках трофобласта при преэклампсии может нарушаться за счет других сигнальных путей.

Preeclampsia (PE) is a serious gestational complication characterized by hypertension, proteinuria and multiple organ failure. PE is the main cause of maternal and perinatal morbidity and mortality worldwide. Nevertheless, the etiology of PE remains unclear. Our study was conducted on the placenta and included 38 patients: 14 with uncomplicated pregnancy; 13 with early PE (rPE); And 11 with late PE (PEE). We analyzed the immunophenotype of cells isolated from the placenta: all biopsy samples were positively stained with antibodies to cytokeratin 7, Sox2, Nestin, Vimentin, and CD44. In the course of the project, a comprehensive study of the level of relative expression of participant genes of various signaling cascades in the mitochondrial medicine laboratory was conducted, which may be involved in the development of pre-eclampsia pathology. The interest genes were studied in biopsy samples of the placenta from women of the control group and early and late preclampsia groups by the Western blot method and real-time PCR. We obtained a significant increase in the mRNA level of the gene and in the production of OPA1 protein in the placentas of rPE. In addition, a decrease in TFAM protein expression was observed in comparison with the control group (p <0.01). The number of copies of mitochondrial DNA in placentas with rPE was significantly higher than in placenta samples from normal pregnancy. We observed an increase in the maximum conjugated respiration in placental mitochondria in the presence of substrates of the I respiratory complex in the rPe group and an increase in the efficiency of oxidative phosphorylation (P / O), citrate synthase activity, and a decrease in Ca2 + induced mitochondrial depolarization rate in both PE groups. Our results indicate a significant contribution of mitochondrial activity to the adaptive response to the development of PE. The balance between fusion and fragmentation of mitochondria allows the cell to adapt to changes in external conditions, such as hypoxia and oxidative stress conditions. Because These changes can serve as evidence of epithelial-mesenchymal transition (EMF) disturbances in trophoblast cells during preeclampsia, the further task was to elucidate the signaling cascade responsible for the implementation of this process. At present, the Wnt path is of particular interest. Therefore, the level of relative expression of EMP markers of the Wnt: N-, E-cadherin, Vimentin (Western blot), SNAI1, beta-catenin and GSK3 beta (real-time PCR with reverse transcription) was assessed. The level of relative expression of the marker of mesenchymal cells of the Vimentin protein (intermediate filament protein) did not differ between groups. The expression of E- and N-cadherins, providing cell adhesion and intercellular contacts, also did not change with early and late preeclampsia. The most important participants in the canonical Wnt-signaling pathway are beta-catenin proteins and GSK3beta protein. The level of relative expression of these genes also did not differ in the groups studied. The relative expression of the SNAI1 transcription factor gene, which is able to suppress the expression of E-cadherin, also remained unchanged. Based on the data obtained, it can be concluded that the functioning of the signaling cascade involving Wnt does not change with early and late preeclampsia, but EMF in trophoblast cells during preeclampsia may be disturbed by other signaling pathways.

планировалось получить: - отчет об экспрессии эпителиальных и мезенхимальных маркеров в апикальной части ворсинок трофобласта, полученного из клинического материала; - отчет об экспрессии эпителиальных и мезенхимальных маркеров во вневорсинчатом пуле трофобласта в норме и при преэклампсии; - гистологическую характеристику сайтов инвазии трофобласта в децидуальную оболочку в норме и при преэклампсии с учетом распределения митохондрий и их специфической активности; - отчет об экспрессии и/или функциональной активности сигнальных путей, вовлеченных в осуществление ЭМП клетками цитотрофобластической колонны и состояние митохондрий. - отчет о структурно-функциональных особенностях митохондриального ретикулума в норме и при преэклампсии в клетках трофобласта

Важным результатом нашей работы является характеристика плацентарной биопсии в изучаемых группах в целях определения клеточного состава. Полученный результат об отсутствии значимых различий в проценте позитивно окрашенных клеток по выбранным маркерам обладает научной ценностью, поскольку аналогичных работ практически не проводилось. Наши результаты касательно экспрессии генов, реализующих сигнальный каскад ЭМП, являются актуальными и достойными внимания научного сообщества, так как вопрос об участии ЭМП в патологии ПЭ сейчас активно обсуждается. При анализе митохондриального аппарата плаценты в изучаемых группах нами было выявлено, что при рПЭ повышается экспрессия важнейшего белка слияния митохондрий OPA1. В случае тПЭ, повышение экспрессии OPA1 в рПЭ может быть частью защитного механизма для стабилизации структуры митохондриома. Белок TFAM является основным активатором транскрипции и репликации мтДНК, а также участвует в поддержании ее целостности (Alam, 2003; Ekstrand et al., 2004). Мы наблюдали снижение экспрессии TFAM при рПЭ, что могло в целом повлиять на функциональность активность митохондрий. Увеличение числа копий мтДНК и низкий уровень TFAM в группе рПЭ может быть объяснено так - связанный с мтДНК TFAM стабилен и выполняет функцию гистона в митохондриях, свободный от мтДНК TFAM неустойчив и быстро деградирует. В нашей работе на изолированных митохондриях плаценты было показано усиление дыхания в присутствии субстратов первого дыхательного комплекса. Индекс эффективности окислительного фосфорилирования (отношение P/O) увеличивался в обеих группах с ПЭ. Раннее в литературе не встречалось сведений об эффективности митохондриального дыхания и его скорости в плаценте при ПЭ. Мы обнаружили значимое увеличение кальциевой емкости изолированных митохондрий плаценты в обеих группах ПЭ по сравнению с контрольными плацентами. Недавнее исследование также показало снижение кальциевого транспорта в митохондриях синцитотрофобласта при ПЭ (Hache et al., 2011).

получено: ходе выполнения проекта была создана коллекция образцов крови и плацентарной ткани, полученной от пациенток, родоразрешенных путем плановой операции кесарево сечение, с диагнозом преэклампсия (умеренная/тяжелая, на любом сроке) и женщин с неотягощенным акушерско-гинекологическим анамнезом (контроль). Критериями включения являлись: 1) возраст от 18 до 45 лет; 2) одноплодная беременность с гестационным сроком от 24 до 40 недель, наступившая самостоятельно; 4) родоразрешение путем операции кесарево сечение. Критериями исключения являлась тяжелая экстрагенитальная патология, включая сахарный диабет, заболевания почек и сердечно-сосудистые заболевания; инфекционные заболевания. Пациентки, включенные в исследование, были объединены в три группы – контрольная группа, ранняя ПЭ (рПЭ, срок гестации до 34 недель) и поздняя ПЭ (пПЭ-срок гестации после 34 недель). Клинические характеристики пациенток приведены в таблице 1. После процессинга в собранных образцах определяли уровень относительной экспрессии генов-участников ЭМП, системы контроля качества митохондрий, маркеров митохондриального биогенеза и окислительного стресса. Нами было обнаружено, что продукция ряда участников изучаемых сигнальных путей изменяется при патологии ПЭ. Более подробные результаты приведены ниже. На начальных этапах работы было важно охарактеризовать клеточный состав плацентарной биопсии, для чего мы использовали метод проточной цитометрии. Для анализа нами были выбраны пять белков: Cytokeratin 7, Sox2, Nestin, Vimentin и CD44. Во всех случаях, анализируемые образцы первичных культур плаценты были положительными по выбранным маркерам. Рис.1. демонстрирует репрезентативный эксперимент, в котором мы наблюдали, что в образце плаценты из группы рПЭ процент клеток, позитивно окрашенных на маркер трофобласта – Cytokeratin 7, был выше, чем в контроле и образцах пПЭ, но различия были статистически не значимы. Уровень Sox2, фактора транскрипции, играющего существенную роль в клеточной дифференцировке, был в пПЭ ниже, чем в плацентарных образцах от нормально протекавших беременностей, но также не достоверно. Кроме того, мы выбрали для анализа промежуточный филамент Nestin, экспрессируемый эндотелиальными клетками и участвующий в ангиогенезе. Уровень белка Nestin в исследуемых группах был схож. Наличие мезенхимальных клеток в плацентарных биопсиях было подтверждено окрашивания белка Vimentin. CD44, рецептор гиалуроновой кислоты, был выбран как маркер стромы и терминальных ворсин хориона и окрашивался также во всех первичных плацентарных культурах. ЭМП – процесс потери клетками признаков эпителиальной ткани (апикально-базальной полярности, экспрессии маркеров клеточной адгезии: N- и E-кадгеринов) и приобретение признаков мезенхимальной ткани (способности к миграции и инвазии) (Kalluri & Weinberg, 2009). Одним из ключевых результатов данной работы можно считать полученные данные об экспрессии маркеров ЭМП в выбранных группах пациенток. При ПЭ наблюдается снижение инвазии трофобласта в материнские спиральные артерии миометрия, вследствие чего нарушается процесс оксигенации плаценты, приводящий к ее гипоксии и повышению артериального давления в организме матери. Исследование маркеров ЭМП позволит оценить участие сигнальных путей ЭМП при патологии ПЭ. Анализ уровня относительной экспрессии белка промежуточных филаментов виментин, как уже упоминалось, маркера мезенхимальных клеток, в ткани плаценты проводили методом Вестерн-блот анализа. Результаты экспериментов не выявили значимых различий в уровне его экспрессии (Рис.2а). Кроме того белками интереса выбрали E- и N-кадгерины, относящиеся к мембранным гликопротеинам, обеспечивающим клеточную адгезию и межклеточные контакты. E-кадгерин участвует в регуляции пролиферации, узнавания и подвижности эпителиальных клеток. N-кадгерин, впервые обнаруженный в клетках нервной ткани, отвечает за межклеточные контакты различных типов клеток, а в период эмбрионального развития наблюдается повышение его количества в мезодерме. N-кадгерин способен связываться с представителями семейства катенинов, белками участвующими в передаче сигнала от поверхности клетки к ядру, в частности в Wnt сигнальном пути. При исследовании этих важнейших молекул клеточной адгезии мы обнаружили, что в плацентах из обеих групп ПЭ уровень их экспрессии схож с образцами из контрольной группы (Рис.2б). При изучении ЭМП в плаценте нам был особо интересен канонический Wnt-сигнальный путь. Его важнейшими участниками являются белок beta-катенин, передающий сигнал о внеклеточном окружении от кадгеринов в ядро, и белок GSK3beta, ключевой регулятор Wnt пути, способный фосфорилировать beta-катенин (He, Semenov, Tamai, & Zeng, 2004). Фосфорилирование beta-катенина является сигналом для его последующей деградации, что означает потерю стимуляторного сигнала от кадгеринов (D. Wu & Pan, 2010). Уровень экспрессии генов beta-катенина и GSK3beta не изменялся в исследованных нами группах женщин (Рис.3a и б). Отталкиваясь от полученных данных, важно было выяснить, меняется ли экспрессия другого важного фактора ЭМП – гена SNAI1, способного связываться с промотором гена Е-кадгерина и репрессировать его транскрипцию. ПЦР-анализ не выявил значимых различий в уровне экспрессии SNAI1 (Рис.3в). Полученные результаты свидетельствуют о том, что, вероятно, Wnt-сигнальный путь не подвержен изменениям при ранней и поздней ПЭ. Возможно, в программе ЭМП клеток плаценты при ПЭ происходят сбои, но они затрагивают другие сигнальные каскады, что, безусловно, требует дальнейшего тщательного исследования. Для определения состояния митохондриального ретикулума в трофобласте плаценты исследуемых групп были выбраны различные маркеры, участвующие в поддержании структуры, функциональной активности митохондрий, белки-участники процессов слияния и фрагментации митохондрий: мембранный канал VDAC1 (своеобразный контроль количества митохондрий), MFN1, MFN2 и OPA1 (белки, ответственные за слияние), DRP1 (фрагментация митохондрий) TFAM (митохондриальный транскрипционный фактор А, активатор транскрипции мтДНК), HIF1alpha (гипоксия-индуцибельный фактор 1 альфа), NRF1 (ядерный дыхательный фактор 1). Было показано, что экспрессия важнейшего мембранного канала VDAC1 понижена в группе рПЭ, однако, это различие не было статистически значимым (Рис.4а). Анализ экспрессии белка TFAM в гомогенате плаценты выявил ее достоверное снижение в группе рПЭ (p<0.05) и падение экспрессии на грани достоверного (p=0.05) в группе пПЭ (Рис.4б). Результаты ОТ-ПЦР-РВ показали, что экспрессия TFAM значимо не различается в контрольной группе и группе рПЭ, однако в группе пПЭ уровень его экспрессии достоверно ниже в 2 раза по сравнению с контролем (Рис.5г). Достоверные различия были выявлены так же для гена OPA1: при рПЭ уровень его экспрессии повышается в 2,5 раза (р<0,05) (Рис.5д). Этот результат подтвердил и вестерн-блот анализ: уровень экспрессии обеих форм OPA1 (1 полоса-соответствует нерасщепленному белку, 2 полоса – расщепленному белку) в группе рПЭ значимо выше по сравнению с контрольными образцами (Рис.4в), что согласуется с данными ПЦР. Нужно отметить, что нам важно было исследовать обе формы белка OPA1, поскольку преобладание одной из форм может свидетельствовать об изменении баланса между слиянием и фрагментацией митохондрий (если доминирует L-OPA1, то происходит элонгация митохондрий, если S-OPA1, то есть расщепленный белок – то фрагментация) Также мы провели пилотное иммуногистохимическое окрашивание образцов плаценты из каждой исследуемой группы на ОРА1 (по 3 образца на группу). Репрезентативные изображения показаны на рисунке 6. Окрашивание OPA1 было в 1,5 раза более интенсивным в плацентарной ткани из рПЭ по сравнению с нормальной плацентой, средняя интенсивность флуоресценции (MFI): изотипический контроль – 15,0±0,5; контрольная группа – 33,3±3,6; рПЭ – 48,2±3,2 *; пПЭ – 33,8±5,8, значения представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение, * - р <0,01 в сравнении с контрольной группой) и этот результат согласуется с предыдущими экспериментами. В случае белка DRP1 (Рис.4г), важного фактора фрагментации митохондрий, не было выявлено достоверных различий в уровне экспрессии. При анализе экспрессии генов MFN1 и MFN2 в группах ПЭ также не было обнаружено значимых различий по сравнению с контролем (Рис 5а,б). Тоже самое относится и к уровню относительной экспрессии генов HIF1alpha и NRF1 (Рис.5в,е). Полученные данные свидетельствуют о важной роли митохондриального аппарата в молекулярной патологии преэклампсии. Показанные в нашей работе изменения в уровне экспрессии генов TFAM и OPA1 могут существенно влиять на степень фрагментации митохондрий, приводя к изменению протяженности митохондриального ретикулума в клетках плаценты, на копийность мтДНК, а также на систему контроля качества митохондрий посредством регуляции процессов митофагии и митохондриального биогенеза. Полученные нами данные свидетельствуют об изменении экспрессии молекул-участников митохондриального слияния и биогенеза не только на уровне транскрипции, но и на белковом уровне в плаценте при ПЭ. В целом, подобные изменения, вероятно, могут быть причиной существенных изменений структурно-функционального состояния митохондриального аппарата клеток плаценты особенно на ранних этапах манифестации преэклампсии. При этом для поздней преэклампсии на уровне транскриптов и белковых продуктов рассмотренных генов отсутствует достоверная разница с контролем, что свидетельствует о фундаментальном различии механизмов формирования патологического состояния при ранней и поздней преэклампсии. Сниженный уровень экспрессии белка TFAM и повышение экспрессии белка OPA1 могут влиять на активность репликации мтДНК. Мы наблюдали значимое увеличение числа копий мтДНК в группе рПЭ по сравнению с контролем. Копийность мтДНК в плацентах контрольной группы и группы пПЭ была на схожем уровне (Рис.7). Нарастание числа копий митохондриальной ДНК при ранней преэклампсии, на наш взгляд, полностью соответствует модели развития данной патологии, так как на фоне повышения экспрессии белка слияния OPA1 и падения уровня фактора транскрипции TFAM, можно говорить о снижении контроля качества митохондрий. Этот процесс определенно носит компенсаторный характер для предотвращения быстрого элиминирования митохондрий при митофагии из клеток в условиях хронического окислительного стресса при ишемии ткани плаценты в случае неполной инвазии трофобласта на ранних стадиях эмбриогенеза. Подобное явления не наблюдается для пПЭ, где, вероятно, задействован иной молекулярный механизм. Кроме того, нами были исследованы дыхательные параметры и фосфорилирующий потенциал выделенных митохондрий плаценты исследуемых групп. Мы использовали полярографическую/амперометрическую технику для оценки эффективности дыхания комплексов митохондриальных мембран. Нами было показано, что эффективность сопряженного дыхания, а следовательно и синтеза АТФ (Рис.8, соотношение Р/О) выше в обеих группах ПЭ по сравнению с контролем. Также мы наблюдали достоверное повышение максимальной скорости сопряженного дыхания изолированных митохондрий в присутствии субстратов I комплекса в группе рПЭ по сравнению с контролем. Можно заключить, что при ранней ПЭ в митохондриях изменяется способность к адаптивной регуляции активности отдельных комплексов дыхательной цепи при сходном максимальном количество потребляемого кислорода на грамм ткани плаценты. Для оценки степени устойчивости митохондрий к внешним воздействиям, например к разобщающим агентам, было исследовано влияние перегрузки ионами кальция на мембранный потенциал изолированных митохондрий плаценты. Кальций был выбран нами для анализа по той причине, что какой-либо патологический стимул может переключать физиологическое действие Са2+ как агента, стимулирующего синтез АТФ, на патофизиологическое действие, превращая Са2+ в агент запускающий открытие митохондриальной транзитной поры, сброс мембранного потенциала, ускорение дыхания митохондрий и, как следствие, генерацию активных форм кислорода (АФК) и, в конечном итоге, апоптоз. Нами впервые было выявлено, что митохондрии плаценты пациенток с преэклампсией менее чувствительны к ионам кальция, чем контрольная группа. Как в группе пПЭ, так и в группе рПЭ скорость сброса потенциала на мембране митохондрий в ответ на добавление кальция в среду была снижена, то есть для открывания кальциевой поры в группах ПЭ требуется более высокая концентрация Са2+, чем в контроле (Рис.9а). На этом фоне при последовательном добавлении протонофора FCCP – агента, разобщающего дыхательную цепь, митохондрии всех исследуемых групп реагировали одинаково (Рис.9б). Стоит отметить, что защитное действие снижения мембранного потенциала при действии протонофоров состоит в уменьшении образования активных форм кислорода при обратном переносе электронов с комплекса II на комплекс I. Другим этапом нашей работы являлась оценка маркеров окислительного стресса в крови женщин на разных сроках беременности в норме и при ПЭ. Нами было обнаружено, что при физиологически протекавшей беременности среднее значение малонового диальдегида (МДА), маркера перекисного окисления липидов, в крови женщин во втором и третьем триместре были достоверно выше по сравнению с первым триместром (p<0.01), при этом уровень МДА в третьем триместре был также достоверно выше, чем во втором (p<0.01, Рис10а). Кроме того, отмечено достоверное увеличение уровня аддуктов пироксинитрита, а именно нитрозильных производных (НП) белков, в крови пациенток с неосложненной беременностью во втором и третьем триместрах по сравнению с первым триместром (p<0.01), а также более высокие значения НП в третьем триместре по сравнению со вторым (р<0.01, Рис10б). Основываясь на полученных результатах, мы заключили, что концентрация конечных продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови увеличивается при прогрессировании беременности. В целом, полученные нами результаты согласуются с представлением о нарастании окислительного стресса при прогрессировании физиологически протекающей беременности. В группе беременных с ПЭ наблюдали сходную динамику содержания МДА при прогрессировании беременности – достоверное увеличение МДА во втором триместре по сравнению с первым (р<0.05) и в третьем по сравнению со вторым (р<0.05). Средний уровень НП был значимо повышен во втором триместре по сравнению с первым (р<0,01), а также выявлена тенденция к его увеличению в третьем триместре по сравнению с первым (р=0.051). Сравнение двух исследованных групп показало достоверное увеличение содержания НП в первом, втором, третьем триместрах в группе беременных с ПЭ по сравнению с группой контроля (Рис.10б). Достоверных различий по уровню МДА между группами выявлено не было. Таким образом, у женщин с беременностью, осложненной ПЭ, наблюдалось повышение содержания в крови продуктов окислительного стресса на фоне ослабления работы антиоксидантной системы. Отдельной частью нашей работы явилось исследование молекулярных механизмов патогенеза ПЭ на ранних сроках гестации с использованием модели гипоксии in vitro. Данная модель широко используется во многих исследованиях (Luo et al., 2016; Q. Wu, Wu, & Li, 2016). Так как гипоксия – это не только результат, но возможно и причина недостаточной инвазии трофобласта в спиральные артерии при ПЭ, нами была отработана методика для культивирования клеток ворсинчатого трофобласта 8-9 недель гестации n=9 в условиях нормоксии (20% О2) и гипоксии (3%). Полученные нами первичные культуры ткани ворсин трофобласта росли в виде монослоя (см. кривую роста, Рис.11). В первые сутки наблюдали заметно более существенный прирост количества клеток в условиях гипоксии, но со временем культивирования разница нивелировалась. ЭМП состоит из быстрых и часто обратимых изменений фенотипа клеток. Под действием индукторов ЭМП, эпителиальные клетки утрачивают плотные контакты, модулируют полярность и реорганизуют цитоскелет: экспрессия промежуточных филаментов переключается с цитокератинов на виментин. Клетки становятся единичными, подвижными, и устойчивыми к апоптозу. Cytokeratin7 относится к семейству белков промежуточных филаментов эпителиальных клеток и экспрессируется в трофобластических клетках ворсин плаценты. Нами показано, что в процессе культивирования смешанной культуры ворсинчатого трофобласта в условиях гипоксии процент Cyt7-позитивных клеток вырастает в 2,5 раза, а в условиях нормоксии в 3,5 раза. В то же время, процент клеток, экспрессирующих vimentin-белок промежуточных филаментов мезенхиальных клеток, не изменялся за время культивирования ни в условиях гипоксии, ни в условиях нормоксии. Особый интерес представляет тот факт, что многие регуляторные пути, задействованные в ЭМП, вовлечены в переход клеток к фенотипу плюрипотентных стволовых клеток. Так Li и соавторы (R. Li et al., 2010) показали, что Sox2 подавляет транскрипцию посредника ЭМП SNAI1. В нашей работе, при оценке процентного содержания клеток Sox2-позитивных как в условиях культивирования при нормоксии, так и при гипоксии не выявлено различий. Процент Sox2-позитивных клеток незначительно снижается (в 0,8 раз) в процессе культивирования. Уровень экспрессии белков, вовлеченных в ЭМП в исследуемых образцах, также оценивали методом вестерн блота. Уровень экспрессии Sox2 недостоверно (p=0.1) увеличивается как при культивировании в условиях гипоксии, так и в условиях нормоксии (Рис.12а). Полученные нами результаты свидетельствуют о достоверном (p<0.05) снижении экспрессии как E-кадгерина, так и N-кадгерина при культивировании как в условиях гипоксии, так и при нормоксии (Рис.12 б,в). Уровень экспрессии Vimentin значимо растет (p<0.05) при культивировании в условиях гипоксии, тогда как при культивировании в условиях нормоксии не изменяется (Рис.12 г). Таким образом, при культивировании в условиях гипоксии мы наблюдали увеличение экспрессии белка мезенхимальной дифференцировки – Vimentin при отсутствии изменений в процентном содержании Vimentin-позитивных клеток. Наряду с этим процент эпителиальных Cytokeratin7-позитивных клеток растет в меньшей степени по сравнению с нормоксией. Полученные нами данные могут свидетельствовать о репрограммировании в область мезенхимальной дифференцировки плаценты на ранних сроках гестации при культивировании в условиях гипоксии. Данные функционального анализа и параметров, характеризующих структуру митохондриального ретикулума, позволяют предположить фундаментальные различия в молекулярных основах патогенеза преэклампсии на ранних и поздних сроках гестации, что при более детальном исследовании и выяснении характера подобных различий позволило бы сформировать высокотехнологичные подходы к ранней диагностике и тактике лечения этого заболевания. Следует отметить, что в группе рПЭ наблюдаемые эффекты более выражены, нежели в группе пПЭ, при этом известно, что у пациенток с рПЭ часто наблюдается более тяжелая клиническая картина. Мы предполагаем, что во время инвазии трофобласта и начале ремоделирования спиральных артерий происходит взаиморегуляция систем, участвующих в инвазии и пролиферации клеток трофобласта, а также селекция клеток, успешно прошедших фильтр отбора по принципу соответствия продукции АФК и потребления кислорода. Так как действующим началом такого отбора является АФК-зависимая индукция апоптотической гибели клеток трофобласта, дисбаланс между процессами энергообеспечения и АФК-продукции в сторону усиления и выхода за пределы количеств необходимых для корректной передачи сигналов, приводит к подъему уровня апоптоза при ранней ПЭ и развитию ассоциированных с этим нарушений инвазии и последующей плацентации. По нашему мнению полученные результаты свидетельствуют о компенсаторном характере изменений, наблюдаемых в группе рПЭ. Вероятно, активная продукция АФК в плаценте данной группы вызывает повреждения мтДНК, белков и липидов митохондрий, вследствие чего митохондриальный аппарат претерпевает структурно-функциональные изменения такие как: активная репликация ДНК, увеличение эффективности дыхания, снижение чувствительности к кальцию, способному стать триггером апоптоза в клетке. Таким образом, можно заключить, что клетки трофобласта противостоят нарастающей угрозе необратимых изменений.