ИСТИНА

В результате выполнения настоящего проекта будет исследована индукция сенесцентности в различных линиях клеток глиобластомы низкими дозами химиопрепарата темозоломида, который применяется в качестве первой линии адъювантной терапии глиобластомы. Будет изучена сенолитическая активность агониста рецептора смерти DR5 в отношении темозоломид-индуцированных сенесцентных клеток глиобластомы in vitro и iv vivo. Ожидается установить корреляцию между повышением популяции сенесцентных клеток и предрасположенностью к DR5-опосредованной клеточной гибели. В итоге выполнения проекта будет установлена ранее не изученная роль рецептора смерти DR5 в элиминации сенесцентных клеток глиобластомы. Новые данные о регуляции резистентности глиобластомы к DR5-опосредованной гибели клеток путем индукции сенесцентности химиотерапевтическими препаратами расширят наши знания о лекарственной устойчивости самого злокачественного типа опухоли головного мозга, а также позволят выявить новые потенциальные биомаркеры чувствительности глиобластомы к таргетной терапии. Кроме того, будут обоснованы новые варианты комбинаторных терапевтических стратегий агонистов рецептора DR5 с химиотерапией для разработки инновационных направлений лечения глиобластомы.

Cellular senescence is defined as an irreversible stop of proliferation caused by various stress factors. Recent research indicate that many chemotherapy drugs are also able to induce senescence in tumor cells. Since senescent cells lose their ability to proliferate, cellular senescence of tumor cells as a result of chemotherapy has long been considered a positive desirable side effect. However, recent studies show that senescent cells can break out of cell cycle arrest and begin to proliferate, leading to tumor recurrence. In addition, they acquire the ability to secrete a wide range of pro-inflammatory factors and molecules, thus contributing to more aggressive tumor development and disease progression. Among the various types of cancers, glioblastoma is one of the most severe, being the most common and deadly malignant primary brain tumor. Despite the progressive development of surgical techniques and the use of adjuvant therapy, the average survival rate does not exceed 12-18 months. Temozolomide, the only adjuvant chemotherapy for glioblastoma, has been shown to induce cellular senescence at low doses. This not only explains the reasons for its low efficiency in the clinic, but also opens up new prospects for the use of senolytics - drugs that eliminate senescent cells. The signaling pathway of TRAIL and its receptors is a component of the immune system that performs immune control, tracking and destruction of transformed cells. Disturbances in this mechanism play an important role in the development of tumor and autoimmune diseases. It has recently been found that agonists of the most important of the TRAIL receptors, death receptor DR5, are able to specifically induce the tumor senescent cells death. However, it is not yet clear whether this mechanism is functional in glioblastoma. The role of the death receptor DR5 in the elimination of glioblastoma senescent cells has never been studied before. As a result of the project, it is expected to establish the role of DR5 death receptor agonists in the elimination of senescent glioblastoma cells induced by low doses of temozolomide. The successful implementation of the project will lay the foundation for the development of new cancer therapeutic strategies.

В результате выполнения настоящего проекта будет исследована индукция сенесцентности в различных линиях клеток глиобластомы низкими дозами химиопрепарата темозоломида, который применяется в качестве первой линии адъювантной терапии глиобластомы. Будет изучена сенолитическая активность агониста рецептора смерти DR5 в отношении темозоломид-индуцированных сенесцентных клеток глиобластомы in vitro и iv vivo. Ожидается установить корреляцию между повышением популяции сенесцентных клеток и предрасположенностью к DR5-опосредованной клеточной гибели. В итоге выполнения проекта будет установлена ранее не изученная роль рецептора смерти DR5 в элиминации сенесцентных клеток глиобластомы. Новые данные о регуляции резистентности глиобластомы к DR5-опосредованной гибели клеток путем индукции сенесцентности химиотерапевтическими препаратами расширят наши знания о лекарственной устойчивости самого злокачественного типа опухоли головного мозга, а также позволят выявить новые потенциальные биомаркеры чувствительности глиобластомы к таргетной терапии. Кроме того, будут обоснованы новые варианты комбинаторных терапевтических стратегий агонистов рецептора DR5 с химиотерапией для разработки инновационных направлений лечения глиобластомы.

Исследована индукция сенесцентности темозоломидом в клеточных линиях глиобластомы человека U87MG, U251, T98G и А172, а также первичных клеточных культур 011, 019, 022 и 067, отобранных с биопсийных образцов пациентов НМИЦ нейрохирургии им. ак. Н.Н. Бурденко с диагностированной глиобластомой. Выявлен гетерогенный ответ различных клеточных культур на индукцию сенесцентности темозоломидом. При этом наиболее ярко выраженные черты сенесцентности наблюдались в клетках линии U87MG. Скрининг клеточных культур глиобластомы человека на чувствительность к агонисту рецептора смерти DR5 – рецептор-специфичному варианту цитокина TRAIL DR5-B показал, что линии клеток U87MG, U251, А172 и первичные образцы 022 и 067 резистентны к цитокину DR5-B, тогда как линия T98G и образцы 011 и 019 обладают чувствительностью к DR5-B. При совместной инкубации с темозоломидом в субтоксичной концентрации выявлен синергичный эффект на клеточной линии А172 и образце 067. В остальных клеточных культурах добавление темозоломида не усиливало цитотоксичность DR5-B. При этом дальнейшее исследование сенолитической активности агониста рецептора DR5, рецептор-специфичного варианта TRAIL DR5-B, показало, что повышение чувствительности клеток глиобластомы к DR5-B коррелирует с выраженностью сенесцентного фенотипа в конкретной клеточной культуре при длительном воздействии темозоломида в субтоксичной концентрации, и сопровождается повышением экспрессии рецептора-мишени DR5 на поверхности клеток. Анализ дифференциальной экспрессии генов в клетках глиобластомы под действием темозоломида в субтоксичной концентрации показал активацию провоспалительных сигнальных путей и стимуляцию экспрессии генов, связанных с сигнализацией TRAIL. Полученные результаты позволяют предположить, что в ходе развития клеточной сенесцентности в клетках глиобластомы под действием темозоломида повышается экспрессия проапоптотических генов и активируется внешний сигнальный путь апоптоза. Проведено сравнительное исследование противоопухолевого действия DR5-специфичного варианта цитокина TRAIL DR5-B in vivo на ксенотрансплантатной модели опухоли глиобластомы человека U87MG в иммунодефицитных мышах Nude в двух альтернативных режимах. В режиме 1 (параллельном) курс лечения темозоломидом проводили одновременно с курсом лечения рекомбинантным препаратом DR5-B. В режиме 2 (последовательном) сначала проводили курс лечения темозоломидом с последующим курсом лечения препаратом DR5-B. В результате выявлено, что как темозоломид, так и DR5-B проявляют противоопухолевую активность в отношении ксенографтов глиобластомы U87MG. При комбинировании двух препаратов противоопухолевое действие значительно усиливалось, однако не было выявлено статистически значимых различий в противоопухолевой эффективности комбинации препаратов в разных режимах. Была исследована индукция сенесцентности в опухолевых ксенотрансплантатах на основе клеточной линии глиобластомы человека U87MG в иммунодефицитных мышах под действием темозоломида методом иммуногистохимического окрашивания опухолевых срезов на экспрессию ингибитора клеточного цикла р21 и маркера клеточной пролиферации Ki-67. Было выявлено, что в опухолях после лечения темозоломидом значительно возрастает экспрессия р21 и снижается экспрессия Ki-67. Повышение экспрессии р21 под действием темозоломида также показано методом вестерн блота, что указывает на остановку клеточного цикла, опосредованно свидетельствующую о развитии сенесцентности. Была исследована химио-индуцированная сенесцентность в опухолевых клеточных линиях иного происхождения, а именно рака поджелудочной железы (РПЖ) человека MIA PaCa-2, PANC-1, BxPC-3 и AsPC-1 под действием химиопрепаратов гемцитабина и доксорубицина. Выявлено, что клеточные линии РПЖ обладали различной восприимчивостью к индукции сенесцентности. Исследование комбинации нескольких маркеров, включающих окрашивание на активность SA-β-gal, клеточную пролиферацию и экспрессию генов CDKN1A (p21) и CDKN1B (p27) показало, что в клетках линии MIA PaCa-2 наблюдалось формирование классического сенесцентного фенотипа после инкубации с химиопрепаратами, в линиях AsPC-1 и PANC-1 присутствовали частичные признаки сенесцентности, а в BxPC-3 они отсутствовали. Это отражает известную гетерогенность клеток РПЖ и создает предпосылки для различной восприимчивости этих клеток к последующей сенолитической терапии. При воздействии гемцитабином либо доксорубицином на клетки нормальных человеческих фибробластов признаков сенесцентности не наблюдалось. Для оценки сенолитического потенциала агониста рецептора DR5, DR5-cелективного варианта цитокина TRAIL DR5-B на клеточных линиях РПЖ была исследована его цитотоксичность после пред-инкубации с доксорубицином или гемцитабином. Инкубация клеток с гемцитабином или доксорубицином приводила к значительному повышению поверхностной экспрессии рецептора DR5 в клетках MIA PaCa-2, PANC-1 и AsPC-1. Закономерно, наблюдалась выраженная сенсибилизация клеток MIA PaCa-2 и PANC-1 к DR5-B. В клетках BxPC-3 выраженного сенолитического эффекта не наблюдалось. Полученный результат согласуется с тем, что эти клетки также не формировали сенесцентный фенотип ни по одному из исследованных критериев. В резистентных к DR5-B клетках AsPC-1 сенолитический эффект DR5-B полностью отсутствовал. При этом инкубация AsPC-1 с доксорубицином или гемцитабином сопровождалась значительным ростом экспрессии cFLIP, ключевого негативного регулятора сигнального пути апоптоза, индуцируемого рецепторами смерти, включая DR5, что может объяснять отсутствие сенолитического эффекта DR5-B в этой линии. В результате выполнения проекта оценена перспектива применения DR5-B и других агонистов рецептора DR5 для лечения пациентов с глиобластомой, прошедших первую линии химиотерапии темозоломидом. Кроме того, оценена перспектива применения агонистов рецептора DR5 на основе препарата DR5-B в альтернативной нозологии рака поджелудочной железы человека.