ИСТИНА

Разработка с помощью методов квантовой химии и молекулярно-динамического моделирования рациональной и эффективной стратегии создания модифицированных мутантных форм родопсинов с улучшенными спектральными характеристиками для применения в оптогенетике при однофотонном и двухфотонном возбуждении

Optogenetics is a method of studying the functioning of excitable cells with the help of light. The method uses membrane proteins - rhodopsins - which are light-dependent ion channels, or pumps, which are built using genetic engineering methods into the membrane of the cells under study. When irradiated with light, rhodopsins cause depolarization or hyperpolarization of the cell membrane, which leads to excitation or, conversely, shutdown of the cell in question. One of the main advantages of this method is that it opens the possibility to control the activity of certain cell types with high temporal and spatial resolution. The study of tissues using rhodopsins, which have a long-wavelength-shifted absorption spectrum, is one of the most important technologies for the development of the method of optogenetics due to the greater depth of penetration into the volume of tissues and the lower phototoxicity of long-wave radiation. Therefore, today many attempts are being made to create such a technology: new types of rhodopsin proteins that absorb in a longer wavelength region are being investigated by experimental search for natural wild-type rhodopsins, molecular screening among mutant forms obtained by random mutagenesis and chimeric proteins, as well as among rhodopsins , in which the chromophore is replaced by structural analogues. This project proposes a different approach to the creation of rhodopsins with a shifted absorption spectrum, namely, it is supposed to use information about the structure of the active centers of a number of rhodopsins for the rational design of mutant forms of proteins, followed by the calculation of their spectral characteristics using quantum chemistry and molecular dynamics modeling methods. The use of computational methods is an integral, essential and primary part of any large-scale research aimed at creating enzymes and proteins with desired properties. Since optogenetics is a relatively young science, most of the rhodopsins needed and already used in this area have not yet been analyzed in detail and in depth by methods of theoretical chemistry, and the potential of these proteins is far from being fully disclosed, which justifies the novelty of the research proposed in this project. It is expected that this approach will make it possible to develop a more rational strategy for designing mutant forms of rhodopsins and will reduce the experimental costs of searching for the desired protein among a large number of randomly mutated and chimeric proteins. Also, this approach will make it possible to avoid competition in binding to the active center between natural retinal and its artificial synthetic analogs in vivo. For the targeted modification of the spectral characteristics and absorption efficiency of rhodopsins, it is important to understand how the protein environment affects the absorption spectrum of these proteins, as well as the speed and selectivity of their primary photochemical reactions. Therefore, an important part of developing a rational design strategy is a detailed theoretical investigation of these fundamental mechanisms of the protein environment's influence on the photophysical properties of rhodopsins. Thus, the goal of this project was to investigate the fundamental mechanisms of functioning of photoactive rhodopsin proteins and develop, using quantum chemistry and molecular dynamics modeling, a rational and efficient strategy for creating modified mutant forms of rhodopsins with improved spectral characteristics for use in optogenetics under single-photon and two-photon excitation. All research tasks for this project were completed.The studies were conducted using modern methods of molecular modeling and high-level quantum chemical calculations in order to study in detail the mechanisms of photochemical reactions in rhodopsins and their photophysical properties. The following main scientific results were obtained: The project identified key structural motifs of the active center that determine the efficiency and rate of photoisomerization of the chromophore group in various types of rhodopsins. Using the example of microbial rhodopsins KR2, bacteriorhodopsin (BR) and bovine visual rhodopsin (BVR) it was established that ultrafast photoisomerization (~180-200 fs in KR2 and BVR) is directly related to the presence of a hydrogen bond between the protonated Schiff base of retinal (RPSB) and its primary counterion, as well as to the preliminary twisting of the polyene chain of retinal. Analysis of the vibrational structure of the electron-vibrational spectra showed that these structural features lead to a specific activation of the stretching and HOOP vibrations of RPSB, which facilitate photoisomerization. In BR (photoisomerization ~500 fs), the absence of such a hydrogen bond and a lower twisting of retinal correlate with a weak intensity of the key HOOP vibrations. The selectivity of reverse photoreactions was also analyzed in detail: in the intermediates of microbial rhodopsins (KKR2, KBR), predominantly one high-frequency vibrational mode along the double bond C13=C14 and the corresponding HOOP mode are active, which ensures a selective reverse photoisomerization reaction. In contrast, in the batho intermediate of visual rhodopsin, high-frequency vibrational modes along the bonds C13=C14 and C11=C12 are active, which reduces the selectivity and quantum yield of the reverse reaction, which is consistent with experimental data and is due to differences in the properties of 13-cis and all-trans isomers of retinal. A theoretical study of the properties of two-photon absorption (TPA) for rhodopsins KR2, BVR and BR was carried out at the level of XMCQDPT2/CASSCF(12,12)/(aug)-cc-pVDZ // EFP theory using the sum-over-states formalism. It was found that the protein environment strongly affects the vertical transition energy (VEE) and the difference in permanent dipole moments (Δμ10) of the ground and excited states: the transition from the isolated chromophore to the QM part causes a blue shift of VEE (0.5–0.8 eV) and a decrease in Δμ10 due to interaction with counterions, while the rest of the protein (MM part) causes a slight red shift of VEE and an increase in Δμ10. For TPA, the fast convergence of N-level models and the applicability of the two-level model (TLM) were confirmed due to the dominance of the PDP mechanism, which is due to the brightness of the S₀→S₁ transition and a large redistribution of electron density. A study of the photophysical properties of the mutant form of rhodopsin KR2 (P219T/S254A) with a red-shifted absorption spectrum was also carried out. Molecular dynamics modeling (25.5 ns) revealed two main conformers of the Thr219 residue. For the wild-type KR2 and both conformers of the mutant form, VEE, permanent dipole moments (PDM), transition dipole moment (TDM), and CTPA and ETPA cross sections were calculated at the XMCQDPT2/SA-CASSCF(12,12)/(aug)-cc-pVDZ // EFP level of theory. VEE calculations confirmed the red shift for the mutant form by ~0.11-0.13 eV, which is consistent with the experiment (0.16 eV). KR2 with the double mutation P219T/S254A showed a slight increase in the CTPA cross section (~380 GM vs. ~370 GM in the wild type), explained by the increase in the TDM, which compensates for the decrease in the difference in PDM. At the same time, the probability of ETPA in the mutant decreased due to a more significant effect of the decrease in the sum of PDMs. The effect of pH on the photophysical properties and conformational mobility of the active site of rhodopsin ESR was also studied within the project. Using metadynamics and QM/MM calculations, a pronounced structural heterogeneity of the ESR active site was established. The main stable conformers were identified, differing in such structural parameters as the presence of a hydrogen bond between Asp85 and RPSB, between His57 and Asp85, and the degree of retinal twisting. Based on the structural criteria described in the literature, the conformers were classified as reactive and nonreactive. Based on the obtained data on the heterogeneity and reactivity of the conformers, a model was proposed that explains the experimentally observed pH dependence of the two-component kinetics of the decay of the excited state of ESR through a change in the ratio of conformers, taking into account their photophysical properties. The obtained results make a significant contribution to the fundamental understanding of the mechanisms of rhodopsin functioning and create a theoretical basis for the rational design of optogenetic tools with improved characteristics.

1.Будет установлен механизм прямых и обратных фотохимических реакций в микробных и животных родопсинах: в родопсине KR2, бактериородопсине и в зрительном родопсине быка. Будет установлено влияние белкового окружения на фотодинамику реакции фотоизомеризации этих родопсинов и на их спектральные свойства. В исследовании будет предложено, как именно белок влияет на активность колебательных мод в выбранных родопсинах и в их первичных интермедиатах. 2.Будет установлено влияние локального белкового окружения мутантных форм родопсина KR2 на сдвиг электронно-колебательных спектров однофотонного поглощения по сравнению со спектром в белке дикого типа. В исследовании будет предложен подход к рациональному выбору мутаций, которые следует провести для получения модифицированных форм со сдвинутым спектром однофотонного поглощения в красную область. Будут рассчитаны спектры конкретных мутантных форм. 3.Будут рассчитаны энергии возбужденных состояний для родопсина KR2, бактериородопсина, зрительного родопсина и мутантных форм родопсина KR2 с двойной мутацией P219T/S254A, а также для них будут рассчитаны компоненты дипольных моментов основного и возбужденных состояний, компоненты дипольных моментов переходов между состояниями, разница между средними дипольными моментами основного и возбужденных состояний. Для данных родопсинов будут рассчитаны сечения двухфотонного поглощения 4.Будет установлена роль локального белкового окружения в обеспечении эффективности двухфотонного поглощения в родопсине KR2, бактериородопсине и зрительном родопсине и в мутантных формах родопсина KR2 с двойной мутацией P219T/S254A. 5.Будет изучено влияние двойной мутаций P219T/S254A в родопсине KR2 на его сечение двухфотонного поглощения. 6.Будет изучена сходимость N-уровневых моделей при расчете сечения двухфотонного поглощения для родопсина KR2, бактериородопсина, зрительного родопсина и для мутантных форм родопсина KR2. 7.Будет изучена возможность применимости двухуровневой модели для расчета сечения двухфотонного поглощения для исследуемых родопсинов. 8.Будет проведено исследование влияния квантовой запутанности фотонов на эффективность двухфотонного поглощения в родопсине KR2 и его мутантных формах. 9.С помощью молекулярной метадинамики будет изучена конформационная подвижность активного центра родопсина ESR при разных pH, а для выявленных ключевых конформеров будет проведена оптимизация геометрии при помощи комбинированного метода квантовой механики и молекулярной механики (КМ/ММ). 10. Будут выявлены и охарактеризованы ключевые структурные параметры, определяющие различия между термодинамически стабильными конформерами родопсина ESR. 11.Будут рассчитаны энергии вертикальных переходов и электронно-колебательные спектры для родопсина ESR при разных pH. 12.Будет изучена взаимосвязь между структурной гетерогенностью активного центра родопсина ESR и кинетикой распада его возбужденного состояния при различных pH.

Руководитель проекта, Кусочек Павел Александрович, имеет большой опыт исследования механизмов фотохимических реакций в биомолекулярных системах, в частности, в области изучения фотофизики и фотохимии ретиналь содержащих белков и их хромофорных групп. Кусочек Павел Александрович является экспертом в области многоконфигурационной квазивырожденной теории возмущений XMCQDPT2. Недавно им были исследованы механизмы безызлучательной релаксации и получены оценки средних времен жизни в возбужденном состоянии изомеров протонированного основания Шиффа ретиналя в газовой фазе. Было показано, что динамика релаксации первого электронно-возбужденного состояния 11-цис изомера протонированного основания Шиффа ретиналя сопоставима с характеристическими временами фотоизомеризации в белках зрительной рецепции, тогда как специфичность реакции и средние времена жизни в возбужденном состоянии полностью-транс изомера протонированного основания Шиффа ретиналя значительно различаются в изолированном состоянии и белковом окружении микробиальных родопсинов. Также руководителем проекта были предложены пути управления сверхбыстрой фотоиндуцированной динамикой изолированного протонированного основания Шиффа ретиналя с помощью химических модификаций структуры хромофора. На основе хромофорной группы ретиналь-содержащих белков с заблокированным внутримолекулярным вращением по центральной двойной связи было показано, что среднее время жизни возбужденного состояния может быть на порядок снижено вследствие возникновения стерических взаимодействий и значительного снижения энергетического барьера безызлучательной релаксации. Руководителем проекта была установлена взаимосвязь между структурой активного центра микробиального родопсина KR2 и фотоиндуцированной динамикой его хромофорной группы на ранних временах. Обнаруженная структурная гетерогенность данного белка позволила объяснить природу его реакционноспособных и нереакционноспособных форм.

В рамках проекта проводились комплексные теоретические исследования фотофизических и фотохимических свойств ряда ключевых бактериальных и животных родопсинов, а также их модифицированных форм. Основными целями проекта являлись: разработка стратегий рационального дизайна родопсинов со смещенным в красную область спектром однофотонного поглощения, изучение механизмов и оптимизация двухфотонного поглощения (TPA) для нужд оптогенетики, а также моделирование механизмов прямых и обратных первичных фотохимических реакций. Работа была сосредоточена на натриевых насосах (НС) типа KR2, а также на классических модельных системах, таких как зрительный родопсин (ЗР) и бактериородопсин (БР). Также в работе был рассмотрен родопсин ESR. Исследования проводились с использованием современных методов молекулярного моделирования, включая молекулярную динамику (МД), комбинированный метод квантовой механики и молекулярной механики (КМ/ММ) и высокоточные квантово-химические расчеты на основе многоконфигурационной квазивырожденной теории возмущений второго порядка (XMCQDPT2) в сочетании с методом потенциалов эффективных фрагментов (EFP). 1. Исследование механизмов фотоизомеризации и спектральных свойств родопсинов дикого типа (родопсина KR2, зрительного родопсина (ЗР), бактериородопсина (БР) ) Было проведено моделирование механизмов прямых и обратных фотохимических реакций в выбранных родопсинах для понимания факторов, определяющих скорость и селективность фотоизомеризации. На основе анализа литературы были выбраны родопсины KR2 и ЗР, обладающие наивысшей скоростью фотоизомеризации (~180-200 фс), и БР (~500 фс) в качестве объекта для сравнения. Для этих белков были построены полные атомистические модели реагентов и их первичных фотохимических интермедиатов (K-интермедиата для KR2 и БР, Бато-интермедиата для ЗР) на основе кристаллических структур из банка PDB. Модели были уравновешены методом молекулярной динамики (МД) в водном окружении, после чего их геометрии были оптимизированы методом КМ/ММ (PBE0/(aug)-cc-pVDZ//AMBER). Для оптимизированных структур были рассчитаны энергии вертикальных переходов (VEE) и однофотонные электронно-колебательные спектры Франка-Кондона с использованием подхода XMCQDPT2/SA CASSCF(12,12)/(aug)-cc-pVDZ // EFP. На основе анализа литературы и последующего детального моделирования были исследованы факторы, определяющие скорость и селективность фотоизомеризации протонированного основания Шиффа ретиналя (РПШО) в родопсинах KR2, ЗР и БР. Структурные особенности активных центров: КМ/ММ оптимизированные структуры (уровень PBE0/(aug)-cc-pVDZ//AMBER) показали, что активные центры KR2 и ЗР, обладающих сверхбыстрой фотоизомеризацией (~180-200 фс), характеризуются наличием сильной водородной связи между первичным противоионом и РПШО, а также сильной скрученностью ретиналя в основном электронном состоянии вокруг фотоизомеризуемой двойной связи C13=C14 в KR2 и вокруг двойной связи C11=C12 в ЗР. В бактериородопсине, с более медленной фотоизомеризацией (~500 фс), водородная связь противоион-РПШО отсутствует (заменена связью через молекулы воды), и ретиналь скручен слабее, чем в родопсине KR2. Таким образом, установлено, что образование водородной связи между противоионом и основанием Шиффа, а также исходная скрученность ретиналя, являются важными структурными элементами, ускоряющими реакцию фотоизомеризации. Роль белкового окружения в активации колебательных мод: Анализ рассчитанных электронно-колебательных спектров Франка-Кондона (метод XMCQDPT2/SA CASSCF(12,12)/(aug)-cc-pVDZ // EFP) и факторов Хуанга-Рис выявил, что белковое окружение KR2 и ЗР специфически активирует высокочастотное валентное колебание и HOOP-колебание при той двойной связи, которая фотоизомеризуется (C13=C14 в KR2; C11=C12 в ЗР). Эти два типа колебаний совместно способствуют эффективному протеканию фотоизомеризации. В отличие от этого, в изолированных изомерах РПШО в газовой фазе активны колебания вдоль нескольких двойных связей, но их интенсивности ниже. В БР, HOOP-колебание при связи C13=C14 обладает значительно меньшей интенсивностью, чем аналогичное колебание в KR2, что связано с более слабой скрученностью ретиналя в БР. Снижение интенсивности HOOP-колебаний рассматривается как одна из причин более низкой скорости фотоизомеризации РПШО в БР по сравнению с KR2. Селективность обратных фотореакций в интермедиатах: Анализ факторов Хуанга-Рис для первичных интермедиатов (интермедиата родопсина KR2 (KKR2), интермедиата ЗР (Бато), интермедиата БР (KBR) ) показал существенные отличия от реагентов. Интенсивность HOOP-колебаний в интермедиатах значительно выше, так как ретиналь после изомеризации находится в более напряженной, скрученной конформации. В интермедиатах KKR2 и KBR интенсивными являются только одна высокочастотная колебательная мода вдоль связи C13=C14 и одна соответствующая HOOP-мода. Эти колебания совместно способствуют обратной реакции фотоизомеризации селективно вокруг связи C13=C14. В интермедиате Бато активными становятся колебательные моды вдоль связей C13=C14 и C11=C12, а также соответствующие HOOP-моды. Это делает обратную реакцию фотоизомеризации зрительного родопсина менее селективной и обладающей меньшим квантовым выходом по сравнению с обратными реакциями в KR2 и БР. Эти расчетные данные согласуются с экспериментальными результатами по квантовым выходам обратных реакций (для БР квантовый выход в пять раз выше, чем для ЗР) и объясняются различиями в свойствах изомеров ретиналя. Так, в газовой фазе 13-цис изомер РПШО из интермедиатов KKR2, KBR изомеризуется на порядок быстрее, чем полностью-транс изомер из Бато. 2. Влияние белкового окружения на двухфотонное поглощение (TPA) родопсинов (KR2, ЗР, БР) Было проведено исследование двухфотонного поглощения выбранных родопсинов (KR2, ЗР, БР), так как использование TPA в оптогенетике перспективно для увеличения глубины проникновения света и снижения фототоксичности. Были рассчитаны компоненты постоянных дипольных моментов основного (S₀) и первого возбужденного (S₁) состояний, а также дипольные моменты переходов между различными электронными состояниями для KR2, ЗР и БР на уровне XMCQDPT2/CASSCF(12,12)/(aug)-cc-pVDZ // EFP. Для изучения влияния белкового окружения расчеты проводились для трех систем: изолированный хромофор (в геометрии из белка), изолированная КМ-часть и весь белок. Сечения TPA рассчитывались с использованием формализма суммы по состояниям, анализировалась сходимость N-уровневых моделей (NLM) и применимость двухуровневой модели (TLM). Влияние белкового окружения на VEE и на разность постоянных дипольных моментов (Δμ10): Установлено, что ближайшее белковое окружение (особенно противоионы) вызывает значительный синий сдвиг VEE (0.5–0.8 эВ) и уменьшение Δμ10 по сравнению с изолированным хромофором. Электростатическое поле остальной части белка оказывает противоположный эффект (небольшой красный сдвиг VEE и увеличение Δμ10). Изменения VEE и Δμ10 происходят симбатно, что объясняется стабилизацией основного состояния РПШО противоионом и эффектом Штарка. Применимость моделей TPA и величины сечений классического двухфотонного поглощения (CTPA): Подтверждена быстрая сходимость N-уровневых моделей для CTPA и применимость двухуровневой модели (TLM), указывающая на доминирование PDP-каналов. Это обусловлено яркостью перехода S₀→S₁ и большим перераспределением электронной плотности. Обнаружена корреляция между увеличением сечения CTPA и ростом Δμ10. KR2 обладает наибольшим расчетным сечением CTPA, что хорошо согласуется с его наибольшим значением Δμ10. Вычисленные величины сечений двухфотонного поглощения родопсинов хорошо коррелируют по порядку величины с экспериментальными данными по канальному родопсину ChR2, а также с предшествующими теоретическими оценками сечений двухфотонного поглощения для ЗР, которые были рассчитаны при помощи другого КМ/ММ подхода. Предсказано, что мутации, приводящие к красному смещению однофотонного поглощения (часто связанные с ростом Δμ10), должны также увеличивать сечение TPA. 3. Разработка и исследование мутантной формы KR2 (P219T/S254A) для модуляции однофотонного и двухфотонного поглощения На основе выводов, сделанных в ходе выполнения проекта, о связи красного смещения и увеличения TPA, а также в соответствии с задачей по созданию модифицированных родопсинов, было проведено целенаправленное исследование мутантной формы KR2. Проведен анализ литературы для выявления аминокислот, влияющих на спектр поглощения. Установлено, что полярные остатки у β-иононового кольца вызывают красный сдвиг, а уменьшение полярности окружения у основания Шиффа также способствует красному сдвигу. Выбраны мутации P219T (введение OH-группы треонина у β-иононового кольца) и S254A (замена полярного серина на неполярный аланин у основания Шиффа) в KR2. Построена модель мутанта KR2 P219T/S254A, проведено МД моделирование (25.5 нс), выявлены два основных конформера остатка Thr219 (в конформере 1 OH группа Thr219 направлена к РПШО, в конформере 2 – OH к Thr216; соотношение между конформерами ~2:1). Для KR2 дикого типа и обоих конформеров мутанта проведены КМ/ММ оптимизации и расчеты VEE, постоянных дипольных моментов (ПДМ), дипольного момента перехода (ДМП), а также сечений классического (CTPA) и запутанного (ETPA) двухфотонного поглощения (XMCQDPT2/SA-CASSCF(12,12)/(aug)-cc-pVDZ // EFP). Расчеты VEE подтвердили, что двойная мутация P219T/S254A вызывает красное смещение на ~0.11-0.13 эВ по сравнению с KR2 дикого типа, что отлично согласуется с экспериментом (0.16 эВ) и подтверждает правильность выбранной стратегии мутагенеза для сдвига спектра. Двухфотонные свойства мутанта KR2 P219T/S254A: Подтверждено доминирование PDP-механизма (92-95%) и применимость TLM для расчета CTPA мутанта. Мутант показал небольшое увеличение сечения CTPA (~380 ГМ) по сравнению с диким типом KR2 (~370 ГМ). Это объяснено тем, что увеличение дипольного момента перехода μ10 у мутанта превзошло эффект от уменьшения разности постоянных дипольных моментов S₀ и S₁ состояний. Влияние всего белкового окружения на CTPA мутанта также значительно (изолированный РПШО ~1420 ГМ, изолированная КМ-часть ~349 ГМ). Вероятность запутанного TPA (ETPA) у мутанта, напротив, снизилась. ETPA определяется неклассическим вкладом, зависящим от суммы ПДМ S₀ и S₁ состояний. В мутанте эта сумма уменьшается, и этот эффект оказывается более значимым для ETPA, чем рост ДМП μ10. Установлено, что использование квантово-запутанных фотонов приводит к значительному (на порядок, в 9-14 раз) усилению микроскопической вероятности двухфотонного поглощения для KR2 и его мутанта по сравнению с классическими фотонами. В мутанте P219T/S254A, несмотря на рост CTPA, вероятность ETPA снижается. Это объясняется тем, что мутация приводит к уменьшению как разности, так и суммы ПДМ. Для CTPA рост ДМП компенсирует уменьшение разности ПДМ. Для ETPA уменьшение доминирующей суммы ПДМ оказывается более значимым фактором, чем рост ДМП. Сделан вывод о возможности дальнейшего увеличения CTPA и ETPA путем такого дизайна мутаций, при котором индуцированное электрическое поле будет выровнено с направлением ДМП. 4. Влияние pH на фотофизические свойства и конформационную гетерогенность родопсина ESR Для более глубокого понимания влияния pH структурные и фотофизические свойства родопсинов, было проведено детальное исследование родопсина ESR. Созданы модели ESR для щелочных (депротонированный His57) и кислых (протонированный His57) значений pH. Методом метадинамики исследованы сечения поверхности энергии Гиббса, выявлены и охарактеризованы стабильные конформеры (DCF1, DCF2, PCF1, PCF2, PCF4). Их геометрии оптимизированы методом КМ/ММ. Рассчитаны VEE и электронно-колебательные спектры. На основании найденных конформеров предложено объяснение кинетики распада возбужденного состояния ESR при разных pH Структурная гетерогенность: Методом метадинамики и КМ/ММ оптимизации для моделей ESR с депротонированным His57 (щелочной pH) и протонированным His57 (кислый pH) выявлены и охарактеризованы несколько стабильных конформеров (DCF1, DCF2, PCF1, PCF2 и PCF5). Они различаются наличием/отсутствием ключевых водородных связей (Asp85-РПШО, His57-Asp85) и степенью скручивания ретиналя. Спектральные свойства конформеров ESR: Расчеты VEE показали, что значения VEE могут меняться в зависимости от структуры активного центра и состояния протонирования: происходит сдвиг в красную область спектра при удалении водородной связи (Н-связи) Asp85-РПШО или при протонировании His57. Однако профили электронно-колебательных спектров для разных конформеров при одном pH оказались практически идентичны. Практически идентичные профили спектров для конформеров при одинаковом pH являются следствием того, что в данных конформерах являются активными близкие по частоте высокочастотные валентные колебания двойных связей РПШО, которые, как раз, и вносят основной вклад в ширину спектров и профиль поглощения. Это согласуется с тем, что в эксперименте детектировать разные конформеры при одном pH удается только по кинетике распада возбужденного состояния, а не по форме спектров поглощения. Объяснение pH-зависимой кинетики: Анализ полученных данных в ходе моделирования родопсина ESR был проведен с учетом результатов, полученных нашими коллегами при помощи фемтосекундной спектроскопии действия. В результате экспериментов по фемтосекундной спектроскопии действия наши коллеги установили наличие двух характеристических компонент в кинетике распада возбужденного состояния. Предложенная в данной работе модель объясняет данную экспериментально наблюдаемую двухкомпонентную кинетику распада возбужденного состояния ESR (реакционноспособная компонента (РS) с временами жизни ~0.5-0.9 пс и нереакционноспособная (НРС) с временами ~5-9 пс) через сосуществование нескольких структурно различных конформеров, относительные концентрации которых модулируются pH среды через состояние протонирования ключевого остатка His57 . При высоких значениях pH (например, 9.5, где His57 преимущественно депротонирован), быстрая РS компонента (~0.51 пс) обусловлена реакционноспособными конформерами типа DCF1 (характеризуется водородной связью Asp85-РПШО и скрученным ретиналем). Медленная НРС компонента (~5.1 пс) приписывается нереакционноспособному конформеру DCF2, где H-связь Asp85-РПШО отсутствует. При снижении pH до 7.4, в условиях смешанного состояния протонирования His57, наблюдается небольшое увеличение времени жизни РS (~0.62 пс), что связывается с постепенным ростом доли реакционноспособного конформера PCF1 (протонированный аналог DCF1), который может иметь схожую, но несколько отличающуюся скорость изомеризации, в то время как НРС компонента (~4.7 пс) по-прежнему определяется в основном DCF2. При дальнейшем понижении pH до 5.3 (где преобладает форма с протонированным His57) происходит значительное увеличение времен жизни обеих компонент. Существенное замедление РS компоненты (до ~0.88 пс) объясняется увеличением вклада конформера PCF2. В PCF2, в отличие от PCF1 и DCF1, отсутствует водородная связь между His57 и Asp85; это структурное изменение, предположительно, влияет на заряд Asp85 и, как следствие, на перераспределение электронной плотности в РПШО при фотовозбуждении, замедляя фотоизомеризацию. Одновременное увеличение времени жизни НРС компоненты (до ~8.9 пс) связывается с возможным появлением нереакционноспособного конформера PCF5 (протонированный аналог DCF2), структурные особенности которого также могут приводить к более медленному нереакционному распаду возбужденного состояния. Таким образом, модель успешно сводит воедино специфические структурные изменения в активном центре ESR, вызванные изменением pH, с наблюдаемыми изменениями в фотодинамике. Общие выводы по проекту: 1. Установлено, что белковое окружение определяет высокую скорость и селективность фотоизомеризации в родопсинах первого и второго типов, формируя уникальную структуру активного центра. Ключевыми особенностями этого активного центра, обеспечивающими сверхбыструю и селективную реакцию фотоизомеризации, являются наличие сильной водородной связи между протонированным основанием Шиффа ретиналя (РПШО) и его противоионом, а также значительная скрученность полиеновой цепи ретиналя еще в основном состоянии. Совокупность этих факторов приводит к селективному возбуждению определенных колебательных мод (включая высокочастотные валентные и HOOP-колебания) на ранних этапах фотодинамики, что и обеспечивает направленное и сверхбыстрое протекание фотохимической реакции. 2. Разработана и теоретически подтверждена стратегия рационального дизайна для получения красного смещения в спектре родопсинов. Показано, что стабилизация возбужденного состояния (путем введения полярных групп у β-иононового кольца, мутация P219T) и дестабилизация основного состояния (путем снижения полярности окружения у основания Шиффа, мутация S254A) являются эффективными подходами. На примере мутанта KR2 P219T/S254A подтверждена ее работоспособность: расчетный красный сдвиг энергии на 0.11-0.13 эВ согласуется с экспериментальными данными. 3. Рассчитаны ключевые фотофизические параметры и сечения двухфотонного поглощения для родопсинов KR2, БР, ЗР и мутантных форм родопсина KR2. Установлено, что среди рассматриваемых белков родопсин KR2 обладает наибольшим расчетным сечением ДФП, что коррелирует с наибольшей величиной разности дипольных моментов (Δμ₁₀) в этой системе, обусловленной уникальной структурой активного центра с одним противоионом. 4. Установлен механизм влияния белкового окружения на ДФП через эффект Штарка. Показано, что ближайшие заряженные противоионы создают электрическое поле, направленное противоположно вектору Δμ₁₀, что приводит к синему сдвигу VEE и уменьшению Δμ₁₀. В то же время, остальная часть белковой глобулы создает поле, которое сонаправлено с вектором Δμ₁₀, что вызывает красный сдвиг VEE и увеличение Δμ₁₀. 5. Установлено влияние мутаций P219T/S254A на нелинейные свойства KR2. Сечение классического ДФП (CTPA) незначительно увеличивается, так как рост дипольного момента перехода (ДМП) компенсирует уменьшение разности постоянных дипольных моментов (ПДМ). Вероятность запутанного ДФП (ETPA), наоборот, снижается, поскольку доминирующим фактором становится уменьшение суммы ПДМ, от которой зависит неклассический вклад. 6. Подтверждена высокая эффективность и быстрая сходимость N-уровневых моделей для расчета сечения ДФП во всех исследованных родопсинах. Вклад высоко возбужденных состояний зависит от энергии отстройки и значительно уменьшается при ее увеличении, что обусловливает применимость N-уровневых моделей, где суммирование проводится по конечному числу состояний. В результате для получения точного численного значения сечения ДФП достаточно учета лишь небольшого числа (3-4) низколежащих возбужденных состояний. 7. Доказана применимость упрощенной двухуровневой модели (TLM) для описания ДФП в родопсинах. Установлено, что ее высокая точность обусловлена тем, что переход S₀→S₁ является ярким и сопровождается значительным перераспределением электронной плотности, в результате чего вклад каналов через постоянные дипольные моменты (PDP-механизм) доминирует над вкладами других промежуточных состояний. 8. Установлен эффект значительного усиления ДФП при использовании квантово-запутанных фотонов. Расчеты показали, что микроскопическая вероятность поглощения в KR2 и его мутанте на порядок (в 9-14 раз) превышает таковую для классических фотонов. Это объясняется тем, что постоянные дипольные моменты основного и возбужденного состояний в этих системах почти параллельны, что делает их сумму (от которой зависит запутанное поглощение) значительно больше их разности (от которой зависит классическое поглощение). 9. В ходе исследования с помощью метадинамики было установлено , что активный центр родопсина из эубактерии Exiguobacterium sibiricum, проявляет выраженную гетерогенность. Эта гетерогенность выражается в существовании нескольких термодинамически стабильных конформеров белка как для формы с депротонированным остатком гистидина 57, характерной для щелочных значений pH, так и для формы с протонированным остатком гистидина 57, преобладающей в кислой среде. Структуры, полученные в ходе метадинамики, были уточнены с помощью последующей оптимизации геометрии методом QM/MM. 10. Идентифицированы ключевые структурные параметры, определяющие различия между этими конформерами. К таким параметрам относятся наличие или отсутствие водородной связи между аспартатом 85 и протонированным основанием Шиффа ретиналя, наличие или отсутствие водородной связи между гистидином 57 и аспартатом 85, а также степень скручивания молекулы ретиналя вокруг связи C13=C14. Установлено, что во всем диапазоне pH есть как конформеры, ответственные за образование реакционноспособных возбужденных состояний ESR, так и есть конформеры, ответственные за образование нереакционноспособных возбужденных состояний ESR. На основании детального анализа структурных особенностей каждого конформера и с учетом данных из научной литературы, в частности, о корреляции между строением активного центра и скоростью фотоизомеризации в других родопсинах, была проведена классификация найденных конформеров по реакционной способности. Ключевыми критериями для отнесения конформеров к реакционноспособным служили наличие прямой водородной связи между первичным противоионом аспартатом 85 и протонированным основанием Шиффа ретиналя, а также значительное скручивание полиеновой цепи ретиналя вокруг связи C13=C14. Конформеры, обозначенные в работе как DCF1, PCF1 и PCF2, обладающие такими характеристиками, были отнесены к реакционноспособным, то есть способствующим эффективной фотоизомеризации ретиналя. Напротив, конформеры, такие как DCF2, где прямая водородная связь между аспартатом 85 и протонированным основанием Шиффа ретиналя отсутствовала, а полиеновая цепь ретиналя была более плоской, были классифицированы как нереакционноспособные. Это также относится к предполагаемому протонированному аналогу DCF2, конформеру PCF5, распад возбужденного состояния которых не ведет к образованию фотопродукта. 11. Расчеты энергий вертикальных электронных переходов для найденных конформеров показали смещение полосы поглощения в длинноволновую область как при удалении водородной связи между аспартатом 85 и протонированным основанием Шиффа ретиналя, так и при протонировании гистидина 57. Эти результаты согласуются с представлениями об уменьшении стабилизации основного состояния вследствие изменения электростатического окружения протонированного основания Шиффа ретиналя. Было также установлено, что профили спектров поглощения для различных конформеров, существующих при одном и том же значении pH, практически идентичны. Такое сходство форм спектров объясняется тем, что основной вклад в ширину и форму полосы поглощения вносят близкие по частоте высокочастотные валентные колебания двойных связей в молекуле протонированного основания Шиффа ретиналя, которые оказываются активными во всех этих конформерах. Это объясняет, почему данные конформеры трудно различить экспериментально на основе стационарных спектров поглощения, в то время как их кинетические характеристики, отражающие динамику первичных фотопроцессов и полученные из фемтосекундной спектроскопии, существенно различаются. 12. Предложена схема, объясняющая экспериментально наблюдаемую pH-зависимость кинетики распада возбужденного состояния родопсина ESR. Согласно этой модели, понижение pH от 9.5 до 5.3 приводит к изменению соотношения между конформерами с депротонированным и протонированным гистидином 57 . При высоких значениях pH доминирует конформер DCF1, обеспечивающий быструю реакционноспособную компоненту, и DCF2, ответственный за нереакционноспособную компоненту. По мере снижения pH и увеличения доли форм с протонированным гистидином 57, таких как PCF1 и PCF2, происходит изменение в кинетике распада возбужденного состояния. В частности, возрастание концентрации реакционноспособного конформера PCF2, который из-за отсутствия водородной связи между гистидином 57 и аспартатом 85 обладает более медленной скоростью фотоизомеризации, а также появление нереакционноспособного конформера PCF5, объясняют общее увеличение времен жизни как реакционноспособной компоненты при pH 5.3, так и нереакционноспособной компоненты при pH 5.3.