ИСТИНА

Целью проекта является создание универсальных цвиттер-ионных сорбентов для разделения веществ различной гидрофильности, полярности и заряда. Такие неподвижные фазы позволят использовать одну и ту же колонку для работы в режиме ОФ ВЭЖХ, гидрофильной и ионной хроматографии. Это позволит существенно сократить затраты на приобретение дорогостоящих импортных хроматографических колонок для конкретного режима, что весьма привлекательно в рамках стратегии импортозамещения.

HPLC is widely used to separate and determine compounds of completely different nature using certain mechanisms. Thus, reverse phase (RP) HPLC is indispensable in the analysis of hydrophobic analytes, HILIC is used in the separation of hydrophilic compounds, and ion chromatography is used for determination of ions. However, these modes used individually have limitations, in particular some substances cannot be effectively separated using stationary phases implementing a single retention mechanism. The solution to this problem is the creation of universal sorbents having in their structure various functional groups capable of different interactions. The advantage of such phases is also the possibility of more flexible selectivity control compared to traditional stationary phases, along with the possibility of using universal sorbents in various eluent modes. Zwitterionic sorbents are almost universal for determining different classes of polar substances in HILIC, since they have unique selectivity due to the presence of both positively and negatively charged groups in the structure of the functional layer. However, they are represented by a very small set of columns from foreign manufacturers, which are currently difficult to buy. Until now, most of the HILIC sorbents are based on silica gel, which has advantages such as high mechanical stability and ease of modification. At the same time, silica gel has working range of mobile phases at pH 3-8, which limits use of sorbents based on it in ion chromatography (IC). The creation of zwitterionic functional layers on the surface of the polymer substrate, for example, copolymers of styrene and divinylbenzene (PS-DVB), would expand the possibilities of using these sorbents in the IC mode in addition to HILIC and RP-HPLC. The presence of different chargeв fragments in the structure of the functional layer can also allow simultaneous detection of cations and anions, which is important in the analysis of pharmaceuticals. The goal of the project is to create universal zwitterionic sorbents for the separation of substances of different polarity in different HPLC modes. These stationary phases will allow the same column to be used for RP-HPLC, HILIC and ion chromatography. It will significantly reduce the cost of purchasing expensive imported chromatographic columns for a specific mode, which is very attractive for the import substitution strategy.

Будут получены новые неподвижные фазы с цвиттер-ионными фрагментами в структуре функционального слоя на основе гидрофильных и гидрофобных частиц, способные работать в нескольких режимах ВЭЖХ. 1) Будет осуществлено введение на поверхность гидрофильных частиц силикагеля гидрофобных радикалов наряду с цвиттер-ионными фрагментами. Для этого будут использованы спейсеры с пропильными и бутильными радикалами, а также аминокислоты и аминосульфокислоты. 2) Будет осуществлено введение различных гидрофильных цвиттер-ионных фрагментов в структуру функционального слоя сорбента на основе гидрофобной матрицы ПС-ДВБ с целью получения новых неподвижных фаз, применимых сразу в нескольких вариантах ВЭЖХ. Для сорбентов с ковалентно закрепленными положительно заряженными полиэлектролитами будет осуществлено предварительное введение аминокислот и полиаминокарбоновых кислот у поверхности матрицы. Также будет осуществлена попытка получения полиэлектролитов, формируемых из диглицидилового эфира и полиаминокарбоновой кислоты, и их закрепления на полимерной матрице. 3) Будет установлено влияния конкретных цвиттер-ионных фрагментов, их количества и положения в слое на селективность неподвижных фаз. Будут использованы цвиттер-ионы, содержащие в структуре: а) как слабокислотные, так и сильнокислотные группы – карбоксильные и сульфогруппы; б) разное количество как положительно, так и отрицательно заряженных фрагментов за счет использования различных аминокислот и аминосульфокислот, аминополикарбоновых кислот; в) разную степень замещенности атомов азота в структуре цвиттер-иона (в частности, применение саркозина, N-метилтаурина, иминодиуксусной кислоты для синтеза сорбентов); г) различную степень дистанцирования между структурными фрагментами противоположных зарядов путем использования бифункциональных спейсеров, включая 1,4-бутандиолдиглицидиловый эфир, а также приемов гиперразветвления и чередования цвиттер-ионных и промежуточных аминогрупп в структуре функционального слоя. 4) Будут выбраны условия разделения гидрофобных, гидрофильных и заряженных соединений в различных режимах ВЭЖХ. Среди гидрофильных соединений будет представлено разделение аминокислот, азотистых оснований и нуклеозидов, углеводов, водорастворимых витаминов. Разделение гидрофобных веществ в режиме ОФ ВЭЖХ будет изучено на примере алкилбензолов, фенолов, жирорастворимых витаминов, галогенуксусных кислот. В качестве заряженных аналитов будут изучены условия разделения анионов карбоновых кислот, производных фосфоновых кислот, неорганических анионов, положительно заряженных производных аминов. Также будут изучены условия одновременного разделения и определения катионов и анионов. 5) Будут изучены механизмы удерживания аналитов в режиме ионной, гидрофильной и обращенно-фазовой жидкостной хроматографии для выявления влияния конкретных цвиттер-ионных фрагментов в слое на хроматографические характеристики сорбентов и способов управления их селективностью. На основании полученных данных о вкладе различных механизмов для сорбентов разной структуры будут установлены условия реализации каждого из типов взаимодействий с целью направленного контроля над мультифункциональными свойствами сепарационных материалов. 6) Будет осуществлен поиск наиболее перспективных схем синтеза сорбентов с точки зрения селективности по отношению к соединениям различной природы. На основании полученных данных о влиянии структур на хроматографические характеристики по отношению к конкретным химическим классам веществ будут установлены результативные способы доработки структур многофункциональных неподвижных фаз.

1) Отработана процедура введения вторичных и третичных аминогрупп на поверхность частиц ПС-ДВБ, используемых для дальнейшего модифицирования. 2) Проведено изучение взаимосвязи структуры функционального слоя и хроматографических характеристик получаемых полимерных анионообменников. Участниками коллектива получены результаты по изучению взаимосвязи структуры функционального слоя неподвижных фаз для гидрофильной хроматографии на основе силикагеля и хроматографических характеристик этих сорбентов. 3) Разработаны способы повышения гидрофильности функционального слоя анионообменников и сорбентов для гидрофильной хроматографии зах, поддержанных фондом РФФИ, а также участия в проекте, поддержанным фондом РНФ. а счет использования соединений класса оксиранов, таких как глицидол и эпихлоргидрин. 4) Впервые предложено ковалентное закрепление ионообменного гиперразветвленного слоя на поверхности аминированного ПС-ДВБ за счет чередования стадий алкилирования диглицидиловым эфиром и аминирования первичным амином. 5) Руководителем проекта впервые предложено использование цвиттер-ионных соединений для формирования гиперразветвленного слоя анионообменников, что позволило существенно повысить их селективность по органическим кислотам. 6) Осуществлена первая попытка по использованию цвиттер-ионных неподвижных фаз в режимах ГИХ, ИХ и ОФ ВЭЖХ при использовании аминосульфокислоты во внутренней части гиперразветвленного слоя на поверхности полимерной матрицы. 7) Опыт руководства и участия в проектах, поддержанных фондом РФФИ, а также участия в проекте, поддержанным фондом РНФ. Участники коллектива на высоком уровне владеют навыками синтеза, упаковки и тестирования сорбентов для ионной и гидрофильной хроматографии. Коллектив состоит из молодых ученых, имеющих публикации в ведущих российских и международных высокорейтинговых журналах и являющихся победителями различных конкурсов и лауреатами престижных премий.

В ходе работы синтезировано 8 сорбентов на основе 3 аминопропилсиликагеля и 5 сорбентов на основе полистирол-дивинилбензола (ПС-ДВБ). Формирование функционального слоя на поверхности силикагеля осуществляли путем последовательного закрепления одного либо двух слоев 1,4-батндиолдиглицидилового эфира (1,4-БДДГЭ) в качестве спейсера и цвиттер-ионных функциональных групп с использованием аминокислот: глицина, таурина и иминодиуксусной кислоты, различающихся силой и числом кислотных групп. Модифицирование ПС-ДВБ осуществляли двумя способами – ацилированием или эпоксидированием, т.е. окислением остаточных двойных связей на поверхности полимера. Для формирования функционального слоя на поверхности модифицированного ПС-ДВБ закрепляли цвиттер-ионные цепи, полученные из 1,4-БДДГЭ и саркозина или иминодиуксусной кислоты, после чего прививали положительно заряженные фрагменты, полученные из 1,4-БДДГЭ и диметиламина. Проведена оценка влияния степени разветвленности структуры и природы цвиттер-иона во внешнем и внутреннем слое сорбентов на основе силикагеля на их хроматографические характеристики с помощью модельных смесей сахаров, нуклеозидов, аминокислот, витаминов и органических кислот. Показано, что увеличение степени разветвленности спейсера привело к созданию универсальных сорбентов, применимых в обращенно-фазовом (ОФ) и гидрофильном (ГИХ) режимах ВЭЖХ. Установлено, что увеличение силы кислотной группы цвиттер-иона при замене глицина на таурин во внешнем и внутреннем функциональном слое сорбентов на основе силикагеля привело к двукратному увеличению эффективности для цвиттер-ионных и отрицательно заряженных аналитов, позволяя в случае органических кислот скомпенсировать её потерю на стадии внедрения в структуру второго слоя 1,4 БДДГЭ. Достигнуто разделение 10 кислот до базовой линии за 25 мин с эффективностью до 18000 тт/м. Продемонстрирована универсальность сорбентов на основе ПС-ДВБ на примере разделения соединений разного заряда и гидрофильности в трех хроматографических режимах: гидрофильной, ионной хроматографии (ИХ) с подавлением фоновой электропроводности и обращенно-фазовой ВЭЖХ. Установлено, что модифицирование полимерной матрицы путём эпоксидирования ведет к увеличению гидрофильности сорбентов по сравнению с ацилированием, что положительно сказывается на эффективности в режиме гидрофильной хроматографии по отношению к водорастворимым витаминам и аминокислотам и позволяет повысить разделяющую способность неподвижной фазы. Показано, что основной вклад в удерживание гидрофобных аналитов в режиме обращенно-фазовой ВЭЖХ вносит полимерная матрица. Полученные сорбенты обеспечили разделение 6 водорастворимых витаминов, 7 сахаров, 9 аминокислот, а также 9 нуклеозидов и азотистых оснований в режиме ГИХ, 7 алкилбензолов, 4 жирорастворимых витамина и 9 фенолов в режиме ОФ ВЭЖХ и 14 анионов включая стандартные неорганические анионы, лактат, бромат и анионы алкилфосфоновых кислот в режиме ИХ. Изучены механизмы удерживания аналитов в режимах ИХ, ГИХ и ОФ ВЭЖХ для выявления влияния конкретных цвиттер-ионных фрагментов в слое на хроматографические характеристики сорбентов и способов управления их селективностью. Независимое варьирование кислотности и концентрации буферного раствора подвижной фазы позволило детальнее рассмотреть возникающие эффекты изменения селективности и добиться одновременного определения веществ различной гидрофильности и заряда: катионов, анионов, нейтральных веществ, слабых кислот и оснований. Осуществлена оценка стабильности полученных неподвижных фаз в различных режимах ВЭЖХ, изучение стабильности при кардинальных изменениях состава подвижной фазы при переключении между различными режимами хроматографии, а также влияния смены режима на емкость и эффективность сорбентов. Отмечена высокая стабильность полученных универсальных сорбентов и необходимость некоторого периода уравновешивание после переключения из одного режима хроматографии в другой. Оценена воспроизводимость синтеза универсальных цвиттер-ионных неподвижных фаз на основе разных матриц с различной структурой функционального слоя. Показано, что высокая воспроизводимость хроматографических параметров на сорбентах на основе силикагеля достигается для углеводов, слабоудерживаемых органических кислот, аминокислот и большинства водорастворимых витаминов. Продемонстрирована более высокая воспроизводимость синтеза неподвижных фаз на основе ПС-ДВБ с привитыми цвиттер-ионными полиэлектролитами по сравнению с сорбентами на основе силикагеля с одним слоем цвиттер-ионов. Данные сорбенты продемонстрировали близкие величины факторов удерживания и селективности по отношению к гидрофобным, полярным и заряженным аналитам в трех режимах хроматографии (ОФ ВЭЖХ, ГИХ и ИХ). Подобраны условий пробоподготовки и анализа объектов в различных режимах жидкостной хроматографии и выявлены области практического применения наиболее перспективных универсальных сорбентов. В качестве объектов в основном использовались объекты пищевой промышленности - соки, морсы, сладкие напитки, спортивные напитки, тонизирующие напитки и вина. Продемонстрировано успешное использование сорбентов на основе силикагеля для определения содержания органических кислот, сахаров и витаминов в различных напитках, а также нуклеозидов и азотистых оснований в питательной смеси для бактерий. Неподвижная фаза на полимерной основе успешно применена для анализа напитка в трех режимах ВЭЖХ: определения неорганических и органических анионов в режиме ИХ, водорастворимых и жирорастворимых витаминов в режиме ГИХ/ОФ ВЭЖХ. Произведена оценка метрологических характеристик определения аналитов различной природы с применением полученных сорбентов. Правильность подходов к анализу объектов пищевой промышленности с использованием универсальных цвиттер-ионных неподвижных фаз подтверждена с помощью метода «введено-найдено». Таким образом, весь заявленный план работ успешно выполнен.