|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ПсковГУ |
||
Комплексное исследование механизмов интеграции тканей у базальных многоклеточных животных на примере губок (тип Porifera)НИР
Comprehensive analysis of the tissue integration mechanisms in basal metazoans, sponges (phylum Porifera)
- Руководитель НИР: Лавров А.И.
- Ответственные исполнители: Мельников Н.П., Саидова А.А., Скоренцева К.В.
- Участники НИР: Большаков Ф.В., Борисенко И.Е., Королева А.С.
- Подразделение: Беломорская биологическая станция имени Н.А. Перцова
- Срок исполнения: 14 августа 2023 г. - 30 июня 2026 г.
- Номер договора (контракта, соглашения): 23-74-10005
- Номер ЦИТИС: 123092100052-1
- Тип: Фундаментальная
- Приоритетное направление научных исследований: Физиологические механизмы деятельности, развития и устойчивости организма человека и животных
- Приоритеты и перспективы НТР Российской Федерации согласно Стратегии НТР РФ: возможность эффективного ответа российского общества на большие вызовы
- ПН России: Науки о жизни
- Критическая технология России: Клеточные технологии
-
Рубрики ГРНТИ:
- 34.03.37 Регенерация органов и тканей
- 34.19.01 Общие вопросы
- 34.33.15 Зоология беспозвоночных
- 34.41.02 Общие закономерности морфогенеза, эмбриогенеза и онтогенеза человека и животных
- 34.41.15 Нормальная гистология человека и животных
- Классификатор OECD: Зоология, Биология развития, Цитология, Эволюционная биология
-
Ключевые слова:
транскриптомный анализ, demospongiae, губки, клеточные контакты, calcarea, пролиферация, клеточный цикл, соматические стволовые клетки, реагрегация клеток, репаративная регенерация, эпителий, ткань
somatic stem cells, cell adhesions, proliferation, cell reaggregation, reparative regeneration, epithelium, transcriptomic analysis, calcarea, tissue, cell cycle, sponges, demospongiae -
Описание:
Основной целью проекта является сравнительный анализ механизмов клеточной интеграции в тканях Porifera на примере интегративного исследования интактных тканей и восстановительных процессов. Ключевой задачей проекта является комплексное описание механизмов структурной интеграции (систем цитоскелета, клеточных контактов и их реорганизации), характеристика динамической интеграции (систем возобновления тканей) и сигнальной интеграции (на примере системы контроля активности стволовых клеток), а также попытка проследить функциональную связь между указанными системами как в поддержании гомеостаза интактных тканей, так и ходе восстановления нормальной структуры тканей после повреждений (процессы репаративной регенерации и реагрегации клеток) у губок из удалённых филогенетических групп.
-
Abstract:
Mechanisms of tissue integration underlie the long-term maintenance of tissue homeostasis in multicellular animals. They determine the behavior of cells and their layers in intact tissues, as well as during normal development and regeneration. The current most important task for researchers is the development of a consistent generalized scheme describing the cellular and molecular mechanisms of cell integration in the tissues of multicellular animals. Such a task cannot be solved without comprehensive studies which, on the one hand, would concern the interaction of various integration mechanisms and, on the other hand, would be conducted on representatives of different Metazoa groups (and not only on model species) to obtain the most complete data for comparative analysis The key objective of this project is a comprehensive analysis of the mechanisms of structural, dynamic and signaling integration and a description of their functional relationship both in maintaining the intact tissues homeostasis as well as during the restoration of normal tissue structure after injury (processes of reparative regeneration and cell reaggregation) in sponges (type Porifera) from distant phylogenetic groups. The novelty of our project is provided by the research objects, the comprehensiveness of methods and approaches, and the comparative aspect of the study. The phylogenetic position and unique body organization make sponges one of the most promising groups for functional studies of the tissue integration mechanisms among the basal metazoans and for the subsequent identification of a set of conservative mechanisms. The comprehensiveness of the project is provided by the study of several tissue integration systems and also concerns our methodological approach: we will combine experimental, anatomical-histological, ultrastructural, molecular-biochemical, and bioinformatic methods and approaches for the most complete analysis of various mechanisms of tissue integration in model sponge species. The comparative aspect of the study is provided by the study of sponges from distant phylogenetic groups and the use of several model systems – intact tissues and restorative processes. Comprehensive comparative studies of sponge tissue integration mechanisms at the level of intact tissues and during recovery processes are not carried out in any laboratory in the world. The successful implementation of the project will provide new fundamental data that will significantly complement modern ideas about the origin and early evolution of multicellularity, the evolutionary development and physiology of animal tissues, as well as about the mechanisms of regeneration. The main genes involved in the integration of sponge tissues will be characterized at the bioinformatic level; expression profiles of these genes will be obtained using comparative transcriptomic analysis, real-time PCR and western blotting; the cellular polarity in intact sponge tissues will be described and its rearrangements during the restoration processes will be analyzed at the morphological and ultrastructural levels; the formation and rearrangements of the actomyosin contractile cable during the reparative regeneration of the calcareous sponge Leucosolenia variabilis will be described and the role of the Rho/ROCK signaling pathway in this process will be evaluated; the cell proliferation in both intact tissues and during restorative processes will be studied in details; the system of somatic stem cell, its regulation mechanisms, and the participation of stem cells in restorative processes will be characterized. The successful implementation of the project is guaranteed by the following: all members of the team have extensive experience of studying sponges (intact animals, their normal development and regeneration); all members of the team have successful experience in collaborative studies using all methods required in the project; our team has at its disposal a wide park of scientific equipment (resource centers of Lomonosov Moscow State University, St. Petersburg State University, IDB RAS) and the possibility of long-term work at the White Sea Biological Station.
-
Планируемые результаты:
В ходе выполнения проекта впервые будет проведено комплексное исследование механизмов интеграции тканей у базальных многоклеточных животных на примере губок. Филогенетическое положение и своеобразие организации делает губок одной из наиболее перспективных групп для подобных исследований. Будут получены данные о структурной, динамической и сигнальной интеграции тканей губок с использованием широкого набора методологических подходов: от прижизненных экспериментов до молекулярно-биохимических и биоинформатических исследований. Полученные результаты также будут важны в сравнительном аспекте, т.к. в проекте будут использованы губки из различных филогенетических линий (Halisarca dujardinii - кл. Demospongiae и Leucosolenia variabilis - кл. Calcarea), а исследования будут проведены не только на интактных тканях модельных видов, но и в ходе их восстановительных процессов. В результате реализации предлагаемого проекта будут получены следующие научные результаты: • в транскриптомах модельных видов губок (H. dujardinii и L. variabilis) будут найдены гены белков-регуляторов цитоскелета, клеточных контактов и полярности; компонентов germline mulipotency program (GMP) и core pluripotency machine (CMP), а также белков, связанных с регуляцией пролиферации и стволового состояния клеток. Будет предсказана их доменная структура и филогенетическое положение; • с помощью методов сравнительной транскриптомики, ПЦР в реальном времени и вестерн блоттинга будут получены данные об изменениях характера экспрессии генов белков-регуляторов цитоскелета, клеточных контактов и клеточной полярности; компонентов germline mulipotency program (GMP) и core pluripotency machine (CMP), а также белков, связанных с регуляцией пролиферации и стволового состояния клеток в ходе восстановительных процессов у модельных видов губок; • на морфологическом и ультраструктурном уровнях будет описана клеточная полярность в эпителио-подобных слоях интактных тканях модельных видов губок, а также проанализировано нарушение (изменение) и восстановление клеточной полярности в ходе восстановительных процессов; • будут описаны формирование и перестройка актомиозинового сократительного тяжа (кабеля) в ходе репаративной регенерации L. variabilis. С помощью функционального ингибиторного анализа элементов и эффекторов сигнального каскада Rho/ROCK будет оценена их роль в восстановительных процессах, в первую очередь в сокращении актомиозинового кабеля в ходе репаративной регенерации L. variabilis; • будет детально описана пролиферативная активность клеток в интактных тканях модельных видов губок: будет оценен пролиферативный пул, получены данные по длине клеточного цикла хоаноцитов, выявлены потенциально покоящиеся/редко пролиферирующие клетки, а также описана миграции и судьба потомков пролиферирующих клеток; • будет детально описана пролиферативная активность клеток в ходе восстановительных процессов у модельных видов губок: будут количественно охарактеризованы изменения в пролиферативной активности клеток, изменения длины клеточного цикла и прослежена судьба потомков пролиферирующих клеток; • с помощью функциональных экспериментов по ингибированию/активации сигнальных каскадов и метода WMISH будет охарактеризована система стволовых клеток губок и механизмы ее регуляции на уровне внутренних программ клеток (генов GMP и CPM) и сигнального контекста (Wnt-каскада); • в ходе восстановительных процессов у модельных видов губок с помощью метода WMISH будет оценена экспрессия генов GMP и CPM, а также прослежено поведение и судьба клеток, которые их экспрессируют.
-
Научный задел:
Все члены коллектива имеют большой опыт работы с губками, как с интактными взрослыми животными, так и с процессами их нормального развития и регенерации (Borisenko et al. 2015, 2021, 2022; Ereskovsky & Lavrov, 2021; Ereskovsky et al., 2015, 2017, 2020, 2021; Lavrov & Ereskovsky 2022; Lavrov & Kosevich 2016, 2018; Lavrov et al. 2018, 2020, 2022; Melnikov et al., 2022; Skorentseva et al., 2022); имеют опыт экспериментальных манипуляций и владеют широким спектром методик фиксации и последующей обработки материала для гистологических, ультраструктурных, иммуноцитохимических (визуализация клеточной пролиферации, апоптоза, систем микрофиламентов и микротрубочек) исследований; имеют опыт работы с различными микроскопами (включая лазерные сканирующие конфокальные микроскопы и электронные микроскопы) и проточными цитофлуориметрами; владеют методами молекулярной биологии (выделение нуклеиновых кислот, ПЦР, ПЦР в реальном времени, гибридизация РНК in situ, вестерн-блоттинг). В группе отработаны методики получения и анализа изображений для различных видов световой и конфокальной микроскопии, а также анализа структур цитоскелета. Также члены коллектива владеют методами биоинформатического анализа, необходимыми для поиска и анализа ортологов необходимых генов в транскриптомных базах данных, и проведения исследований по сравнительной транскриптомике. Все перечисленные выше методы и подходы адаптированы для работы с модельными видами губок. Эти методики успешно применялись в реализации проектов по биологии развития губок. Таким образом, у коллектива имеется надежная теоретическая и методологическая база для углубленного изучения тонких механизмов интеграции клеток в составе тканей модельных видов губок, что дает уверенность в успешной реализации поставленных в Проекте задач.
- Добавил в систему: Лавров Андрей Игоревич
Источник финансирования НИР
| грант РНФ |
Этапы НИР
| # | Сроки | Название |
| 1 | 14 августа 2023 г.-30 июня 2024 г. | Комплексное исследование механизмов интеграции тканей у базальных многоклеточных животных на примере губок (тип Porifera) |
| Результаты этапа: Все задачи, поставленные на первый год проекта, выполнены в полном объеме. В ходе выполнения проекта были собраны образцы интактных тканей морских губок Halisarca dujardinii (кл. Demospongiae) и Leucosolenia corallorrhiza и проведены эксперименты по репаративной регенерации L. corallorrhiza (регенерации стенки тела – 108 особей; 40 культур кольцевидных фрагментов) и реагрегации клеток H. dujardinii (80 культур). Были зафиксированы образцы регенератов L. corallorrhiza и многоклеточных агрегатов H. dujardinii на разных стадиях развития для ультраструктурных и иммуноцитохимических исследований, а также для секвенирования транскриптомов и определения уровня экспрессии генов методом ПЦР в реальном времени. На живом и фиксированном материале проведены исследования организации цитоскелета и его перестройки в ходе посттравматической регенерации, охарактеризована пролиферация клеток в интактных тканях и в ходе посттравматической регенерации, проведен биоинформатический поиск и анализ белков в транскриптомных базах данных L. corallorrhiza и H. dujardinii. В транскриптомах исследуемых губок были обнаружены последовательности, кодирующие компоненты PAR-, Scribble- и CRUMBS-ассоциированных комплексов, отвечающих за апико-базальную полярность клеток. Из комплекса белков, отвечающих за плотные межклеточные контакты, у губок, по-видимому, присутствуют только клаудин-подобные белки. Адгезивные контакты губок основаны исключительно на кадгерин-опосредованных взаимодействиях. Из белков-регуляторов клеточного цикла и пролиферации у H. dujardinii и L. corallorrhiza нами были описаны основные компоненты germline multipotency program (GMP). В то же время прямые ортологи белков, составляющих core pluripotency machinery (CPM), у H. dujardinii и L. corallorrhiza обнаружены не были. Однако филогенетические исследования показали, что у губок присутствуют белки, являющиеся предковыми для клад белков CPM. Также идентифицированы ортологи anaphase-promoting complex (APC) subunit 2 и 11, Mdm2, c-myc, Ki-67, Mcm2, PCNA и различные циклины. Сеть микротрубочек и их посттрансляционных модификаций охарактеризована в основных типах клеток L. corallorrhiza как в интактных тканях, так и в регенеративной мембране на различных стадиях её формирования. В основных типах клеток L. corallorrhiza показана более или менее радиальная организация сети микротрубочек. При формировании регенеративной мембраны происходит перестройка сети микротрубочек в экзопинакоцитах и хоаноцитах. Использование непосредственных ингибиторов полимеризации элементов цитоскелета (латрункулин В, нокодазол) приводит к серьезным нарушениям динамики роста регенеративной мембраны. Использование специфических ингибиторов различных уровней регуляции сигнального пути Rho/ROCK, обеспечивающего миграторную активность клетки (блеббистатин, Y-27632), приводит к замедлению формирования регенеративной мембраны. Дополнительно в рамках иммуноцитохимических исследований интактных тканей и регенератов L. corallorrhiza был визуализирован актиновый цитоскелет: методы фиксации и пробоподготовки для визуализации актиновых филаментов и сократимых актомиозиновых структур адаптированы и оптимизированы для получения достоверных результатов. Исследование скорости пролиферации у модельных видов губок показало, что их интактные ткани обладают обширной популяцией пролиферирующих клеток (хоаноцитов), характеризующихся относительно длительным клеточным циклом: полная длительность клеточного цикла хоаноцитов составила 40.3±16.9 ч у H. dujardinii и 58.7±24.7 ч у L. corallorrhiza. Эксперименты по отслеживанию EdU-положительных клеток выявили различную судьбу потомков хоаноцитов у исследованных губок: у H. dujardinii потомки хоаноцитов мигрируют в мезохил и дают начало другим типам клеток через стадию археоцитоподобных клеток; у L. сorallorrhiza отсутствует активная миграция хоаноцитов и их потомков в мезохил. Опыты с модуляторами сигнального каскада Wnt показали, что напрямую повлиять на активность пролиферации с помощью модуляции Wnt-каскада в интактных тканях губок не представляется возможным. Исследования пролиферации клеток в ходе посттравматической регенерации у модельных видов выявили изменения в характере пролиферации на разных стадиях изученных процессов. В ходе реагрегации клеток и развития многоклеточных агрегатов H. dujardinii происходят значимые изменения количества синтезирующих ДНК (EdU+) клеток. На ранней стадии реагрегации (PMA) агрегаты содержат значительное количество EdU-положительных клеток; при преобразовании агрегатов в настоящие примморфы (TP) происходит резкое падение количества EdU+ клеток; в ходе дальнейшего прогрессивного развития многоклеточных агрегатов доля EdU+ клеток значимо растёт, достигая к концу процесса реагрегации уровня интактных тканей губки. Доля митотических (pH3+) клеток была низкой на всех исследованных стадиях реагрегации, но демонстрировала динамику, сходную с EdU+ клетками. В ходе репаративной регенерации L. corallorrhiza в интактных тканях около раны и на удалении от неё сохраняется активная пролиферация клеток, но в регенеративной мембране пролиферирующие клетки отсутствуют. В интактных тканях около раны наблюдается снижение доли EdU+ клеток на стадиях растущей и полной мембраны. В интактных тканях на расстоянии доля EdU+ клеток не меняется. Доля pH3+ клеток остается на одном уровне на протяжении всего процесса регенерации как в тканях около раны, так и на удалении от неё. | ||
| 2 | 1 июля 2024 г.-30 июня 2025 г. | Комплексное исследование механизмов интеграции тканей у базальных многоклеточных животных на примере губок (тип Porifera) |
| Результаты этапа: Все задачи, поставленные на второй год проекта, выполнены. В этом году в рамках проекта были поставлены эксперименты по репаративной регенерации Leucosolenia corallorrhiza и реагрегации клеток Halisarca dujardinii . Зафиксированы образцы для проведения ультраструкутрных и иммуцитохимических исследований, а также для оценки экспрессии генов на уровне мРНК и белка. Начата отработка протокола гибридизации нуклеиновых кислот in situ. Для верификации данных дифференциальной экспрессии генов и последующего точечного анализа экспрессии целевых генов и обеспечения универсальности анализа получаемых в экспериментах данных, была доработана панель референтных генов для ПЦР-РВ. Был проведен анализ дифференциальной экспрессии генов в процессах реагрегации H. dujardinii и репаративной регенерации L. corallorrhiza. Временные паттерны экспрессии изучали с помощью кластеризации транскриптов по их коэкспрессии с помощью метода fuzzy c-means. В ходе реагрегации клеток H. dujardini многие сигнальные пути демонстрируют дифференциальную экспрессию; большая часть транскриптов, ответственных за поддержание стволовых клеток, демонстрировала повышение экспрессии на ранних стадиях реагрегации; транскрипты-маркеры пролиферации снижают свою экспрессию на протяжении всего периода реагрегации. Большинство транскриптов, связанных с полярностью, эпителиально-мезенхимальным переходом и регуляцией актинового цитоскелета, показали значительное увеличение экспрессии на ранних стадиях реагрегации клеток H. dujardinii. По данным обогащения в GO- и KEGG-терминах в ходе регенерации L. corallorrhiza происходит увеличение экспрессии компонентов сигнальных путей (TNF-, MAPK-, Rap1- и FoxO-сигнальный путь) на ранних стадиях регенерации. В это же время кластеры с понижающими экспрессию транскриптами были обогащены в терминах, связанных с клеточной пролиферацией и синтезом ДНК. Большая часть связанных с актиновым цитоскелетом транскриптов не демонстрировала дифференциальной экспрессии. Это позволяет предположить, что наблюдаемые в ходе регенерации морфологические изменения актинового цитоскелета у L. corallorrhiza в первую очередь обеспечиваются на белковом уровне, а не регулируются транскрипционно. Для подтверждения этой гипотезы, были поставлены эксперименты по репаративной регенерации L. corallorrhiza в присутствии трёх ингибиторов иерархически разных этапов функционирования Rho/ROCK сигнального каскада: блеббистатина, SMIFH2 и Y27632. Проведенные эксперименты достоверно демонстрируют эффект от применения этих ингибиторов на динамику формирования регенеративной мембраны и позволяют предложить реорганизацию актиновых филаментов и формируемых ими сократительных структур как основу регуляции репаративного морфогенеза L.corallorrhiza, осуществляемую на белковом уровне. Кроме того, были описаны особенности распределения цитоплазматических изоформ актина в клетках L. corallorrhiza в норме и при регенерации. Удалось показать, что в тканях L. corallorrhiza существует специфическое распределение цитоплазматических изоформ актина, и, согласно первичным наблюдениям, изменение их экспрессии в процессе регенерации может свидетельствовать о наличии функциональной роли этих изоформ в обеспечении миграторной активности клеток губки. Были продолжены детальные исследования пролиферации клеток в интактных тканях и в ходе регенеративных процессов у исследуемых видов губок. Был отработан протокол двойного мечения клеток в S-фазе клеточного цикла с помощью BrdU/EdU. Применение этой методики значительно улучшит расчеты параметров клеточного цикла пролиферирующих клеток. Были проведены эксперименты по длительному отслеживанию метки EdU в интактных тканях с целью выявления медленно делящихся популяций клеток. Однако собранные данные указывают на активное возобновление тканей у исследуемых губок, так как “разбавление” метки EdU говорит об активном делении потомков включивших метку клеток. При этом не зафиксированы клетки, сохраняющие интенсивность окраски: по-видимому, а) дифференцированные потомки таких клеток обладают малым сроком существования, б) редко делящиеся клетки в тканях исследуемых губок или отсутствуют, или крайне редки. Эксперименты по отслеживанию судьбы пролиферирующих клеток и их потомков в ходе реагрегации клеток H. dujardinii показали, что клетки, получившие метку EdU в интактных тканях, переживают диссоциацию тканей и принимают активное участие в процессе реагрегации клеток и восстановления исходной организации губки. Учитывая, что исходно в интактных абсолютное большинство EdU+ клеток (~95%) являлось хоаноцитами, полученные данные указывают на широкие морфогенетические потенции этого типа клеток при восстановительных морфогенезах у H. dujardinii. Также было поставлено два эксперимента по отслеживанию судьбы пролиферирующих клеток и их потомков в ходе репаративной регенерации L.corallorrhiza; полученные данные указывают, что пролиферирующие хоаноциты не принимают участия в формировании регенеративной мембраны, но могут участвовать в ее трансформации в интактную стенку тела. В 2024-2025 году по в ходе проекта выполнения проекта подготовлено и опубликовано 3 статьи в международных научных журналах Q1. В работе находятся еще три рукописи. | ||
| 3 | 1 июля 2025 г.-30 июня 2026 г. | Комплексное исследование механизмов интеграции тканей у базальных многоклеточных животных на примере губок (тип Porifera) |
| Результаты этапа: | ||
Прикрепленные к НИР результаты
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".