ИСТИНА

Цель дальнейшего развития проекта – продолжить создание фундамента для разработки чувствительных и селективных, простых и экспрессных сенсорных платформ для определения физиологически активных веществ в биологических объектах, способов дифференциации объектов сложного состава оптическими методами. К актуальным задачам развития этих методов относятся: упрощение аналитических методик за счет создания готовых к использованию сенсорных элементов, минимизации операций пробоподготовки (или ее отсутствие), значительное сокращение времени анализа, улучшение метрологических характеристик (чувствительности и воспроизводимости); расширение возможностей аналитических методов за счет соединений, не типичных для определения флуориметрическими методами; применение обычного серийного оборудования или фотоаппаратуры, переход к портативным системам.

The goal of further development of the project is to continue creating the foundation for the development of sensitive and selective, simple and rapid sensor platforms for determining physiologically active substances in biological samples, methods for differentiating samples of complex composition by optical methods. The urgent tasks of developing these methods include: simplification of analytical procedures by developing ready-to-use sensor elements, minimizing sample preparation operations (or its absence), significant reduction in analysis time, improvement of metrological characteristics (sensitivity and reproducibility); expanding the possibilities of analytical methods due to compounds that are not typical for determination by fluorimetric methods; the use of conventional serial equipment or photographic equipment, the transition to portable systems. To solve the problem of selective determination of analytes in complex matrices, highly sensitive multisensor platforms will be proposed, multifunctional composite films and gels containing selective recognition agents will be developed; a directed selection of spectral characteristics will be carried out depending on the nature of the analyte and the matrix of the biological sample. In order to develop optical methods for the determination of organic analytes using plasmonic nanostructures, 2D and 3D composite structures will be developed made of natural polymeric materials (chitosan, collagen, alginate) with immobilized nanoparticles of metals or their ions and indicator compounds with specified spectral and physico-chemical characteristics. Such structures will have a high sorption capacity with respect to the analyte and the sample matrix in order to increase the sensitivity and reproducibility of the analysis and reduce the response time of the sensor layer. The developments in these areas at the previous stage of the project implementation showed their promise, made it possible to carry out the determination of low- and high-molecular biologically active substances in matrices of complex composition without complicated sample preparation with high sensitivity and selectivity (including multiplex detection). In continuation of the development of the project, we will continue research with low-molecular compounds, markers of neurodegenerative and neuroendocrine diseases, as well as diagnostic proteins, but at the same time the range of objects will be expanded, primarily through cell cultures, biological fluids, where the determination of these compounds is extremely important; we will continue development of approaches to their multiplex determination, transition from the stage of in vitro analysis to ex vivo. In connection with the relevance of developing highly sensitive, selective and, most importantly, rapid sensor systems for diagnosing bacterial infections without preliminary inoculation of the biomaterial, approaches will be created for the determination of new classes of analytes - specific pigments (quinone, azaquinone, carotenoids, melanin, pyrrole, phenazine, pyrazine) and enzymes (catalase, cytochrome-C-oxidase) of various bacteria, including pathogenic ones. In order to develop effective methods for discrimination of water- and organic-soluble samples, we will develop a version of the "fingerprint" method proposed by us within the framework of the project, based on the use of the kinetic factor. New indicator reactions will be proposed (oxidation of carbocyanines, formation of hydrazones and azomethines) and on their basis simple and rapid methods of discrimination of fats, oils, foodstuffs, biological fluids will be developed, which will allow solving practical problems of determining the manufacturer, identifying counterfeits, diagnosing diseases, etc. Attention will also be paid to the use of the "fingerprint" method for the identification of drugs. All developed methods and approaches and developed sensor platforms based on them will be tested in the analysis of real samples.

Ожидаемые результаты 2023 г.: Будут созданы новые универсальные 2D- и 3D-полимерных матриц (пленки, гели, губки), которые будут служить одновременно основой нанокомпозитной сенсорной системы, сорбционным материалом для удерживания наночастиц различной природы, ионов металлов в на поверхности сенсора, различных индикаторов, а также для извлечения, концентрирования и направленного транспорта молекул-аналитов различной полярности из сред разного состава (в зависимости от задачи исследования). Будут выбраны наиболее эффективные синтетические и методические приемы конструирования оптической наноструктурированной поверхности в результате варьирования способов их получения под различные аналиты. Методами оптической, сканирующей электронной и атомно-силовой микроскопии будет изучена и выбрана оптимальная морфология поверхности создаваемого материала. Будут разработаны индикаторные системы для определения молекул-маркеров бактериальных инфекций (диагностических пигментов и ферментов). Будут выбраны подходящие индикаторные реакции и предложены новые для использования в «методах отпечатков пальцев» и получены данные о влиянии стандартного набора модельных аналитов на их протекание. Будут разработаны простые и экспрессные способы дискриминации объектов сложного состава (напитков, продуктов питания, в том числе подвергнутых радиационной обработке для определения ее дозы, биологических жидкостей и др.). Будет создана линейка индикаторных реакций, протекающих в неводной среде и направленных на анализ органикорастворимых объектов; будут изучены свойства этих реакций в отношении органикорастворимых модельных аналитов. Будут разработаны эффективные методики дискриминации жирорастворимых объектов (моторных масел, пищевых жиров, топлив, эфирных масел и т.п.). Будет предложена кинетическая модель протекания некоторых наиболее важных реакций и определены константы скоростей отдельных стадий в этой модели. Хлорофилл а будет впервые использован в качестве аналитического реагента для определения бета-лактамных антибиотиков (на примере пенициллина) в виде флуоресцирующих тройных агрегатов.

Коллектив заявителей имеет значительный научный задел по созданию твердофазных сенсорных устройств, основанных на флуоресценции и спектроскопии комбинационного рассеяния, индикаторных систем на основе гелей и пленок из природных полимеров для определения биологически активных соединений различных классов. Коллектив имеет опыт по направленному синтезу наночастиц благородных металлов (Au и Ag), владеет навыками по получению наноструктурированных металлических (Ag, Au, Pt, Pd и др.), магнитных материалов и стабильных суспензий на их основе, в частности, с использованием различных методов химической гомогенизации для получения высокодисперсных материалов (метод пиролиза аэрозолей, магнетронное напыление, фотохимическое разложение, синтез в высококипящих растворителях, синтез в микроэмульсиях и др.) Авторами проекта созданы новые подходы к определению синтетических водорастворимых полимеров, в частности, дезинфектанта – полигексаметиленгуанидина (ПГМГ, торговые марки "Биопаг, "Полисепт"), методами флуориметрии и Рэлеевского рассеяния. Методики отличаются более широкими диапазонами линейности и более низкими пределами обнаружения, чем все известные оптические методы определения ПГМГ. Авторами проекта предложен вариант флуориметрического метода "отпечатков пальцев" («флуоресцентный язык» или «глаз»), заключающийся в добавлении к образцу флуорофора или смеси флуорофоров и измерении спектров флуоресценции или получении цифровых фотографий. Метод ценен в случаях, когда анализируемые образцы слабо флуоресцируют, или собственная флуоресценция не фиксируется имеющимся оборудованием, или дискриминирование образцов по собственной флуоресценции недостаточное. У заявителей имеются навыки эффективного использования сложного синтетического и аналитического оборудования отделения ФНМ ЦКП МГУ, в том числе оборудования, которое планируется непосредственно использовать для выполнения проекта.

За пятилетний срок работ по проекту логика развития исследований привела нас к тому, что кроме гетерогенных сенсорных элементов мы начали изучать гомогенные, а количественный анализ дополнили методами распознавания объектов. Ниже приведено резюме полученных за два года результатов. Продолжено развитие кинетического варианта оптического метода «отпечатков пальцев», основанного на проведении индикаторных реакций в присутствии образцов с мониторингом светопоглощения и интенсивности флуоресценции в разных диапазонах в разные моменты времени фотографическим методом. Изучен ряд новых индикаторных реакций, в частности, предложено использовать реакции окисления красителей гипохлоритом, который ранее не использовали в кинетических методах. Предложено использовать как окислители продукты реакции белка с гипохлоритом, на основе чего созданы индикаторные реакции. Найдено, что наилучшее распознавание различных объектов достигается с использованием редокс-реакций, тогда как реакции других типов пока не могут составить им конкуренции. Наиболее высокие правильности распознавания (выше 90%) достигнуты именно с помощью реакций окисления карбоцианинов гипохлоритом, в том числе в присутствии таких белков, как глобулин и лизоцим (образуются хлорамины, которые сами выступают как окислители); эффективны также реакции окисления карбоцианинов пероксидом водорода или кислородом воздуха. Перечисленные реакции оказались и наиболее универсальными (применимыми к нескольких типам объектов). Найдены перспективными реакции фотохимического окисления карбоцианинов. Попытки использовать окисление красителей других классов были менее успешными, возможно, по той причине, что продукты поглощали и/или флуоресцировали в меньшем числе диапазонов, что не позволяло расширить объем получаемых данных об образце. Установили, что для распознавания объектов, как правило, достаточно одной индикаторной реакции, что является изменением первоначальной концепции. Ранее мы полагались на параллельное проведение нескольких реакций. Накопленный материал свидетельствует о том, что следует ориентироваться на использование единственной наиболее эффективной реакции, что к тому же упрощает методику. Фактически, вместо массива нескольких сенсорных элементов используется один, но в разные моменты времени, что компенсирует недостаток информации об объекте. Для сравнения эффективности индикаторных реакций использовали «стандартные» объекты (яблочные соки и почвенные вытяжки), в то же время, был расширен круг реальных объектов, распознаваемых кинетическим методом «отпечатков пальцев», – показана возможность распознавать жиры и масла (для жирорастворимых объектов разработана индикаторная система на основе коммерческого карбоцианина Су7-гидразин, окисляемого азотной кислотой в этаноле), а также объекты белковой природы (предложена индикаторная система на основе реакции гипохлоритного окисления карбоцианинов для распознавания сычужных ферментов) и сыворотка крови. Работа с сывороткой крови позволила распознать здоровых индивидов и онкологических больных, что открывает возможность применения подобных индикаторных систем в медицинской диагностике. Достоинства развиваемого варианта метода распознавания объектов – простота методик, быстрое фотографическое измерение интенсивности флуоресценции и светопоглощения/отражения, не требующее полноспектрального оборудования. Вместо обычно используемого нами лабораторного визуализатора для видимой флуоресценции можно использовать камеру смартфона, а для флуоресценции в ближней ИК области применима установка, которую легко собрать и использовать, в том числе вне лаборатории. Реакции протекают за промежуток времени от 20 мин до 2 ч, что приемлемо для большинства задач. Обработку изображений проводят с использовнием стандартного программного обеспечения (ImageJ, XLSTAT). Мы считаем целесообразным дальнейшее развитие предлагаемого варианта метода распознавания объектов. В литературе есть немало примеров распознавания более эффективного, чем в наших работах (в которых, в частности, можно ограничиться методом главных компонент и не требуется дискриминантный анализ), поэтому есть смысл стремиться к повышению правильности распознавания объектов развиваемым методом. Достичь этой цели можно за счет выбора новых индикаторных систем, а также совершенствования пробоподготовки (например, использования предокисления образцов). Кроме того, целесообразно двигаться в сторону полевых, портативных и автономных индикаторных систем, в том числе с использованием смартфонов. Важное направление приложений развиваемого метода – медицинская и ветеринарная диагностика. В частности, целесообразно изучить возможность проведения массовых скринингов населения (или поголовья скота) путем анализа биожидкостей с помощью предлагаемых индикаторных систем. Целесообразно выявить патологии, на которые возможно получить отклик, изучить влияние совместного присутствия нескольких патологий, а также таких факторов, как пол, возраст, принимаемые препараты и др. Имеется в виду, что при получении положительного результата при скрининге индивид или особь будет направляться на углубленное обследование. Методика скрининга может быть признана успешной, когда количество ложноотрицательных результатов будет сведено к минимуму, то есть случаи заболевания не будут пропущены. Предлагаемый вариант скрининга будет дешевле высокотехнологичных селективных тестов, которых к тому же требуется провести как минимум несколько для одного индивида или особи. В области создания оптических сенсорных элементов для спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния разработаны 2D- и 3D-гибридные пористые плазмонные материалы на основе хитозана, нейлона и наночастиц серебра с коэффициентом усиления комбинационного рассеяния вплоть до (5.1 ± 0.4) × 10⁵. Компонента на основе нейлона обеспечивает высокую механическую прочность композита в процессе эксплуатации; хитозановая компонента обеспечивает оптическую прозрачность при анализе методом комбинационного рассеяния, а также демонстрирует высокое сродство к наночастицам серебра и как следствие, их плотное покрытие по поверхности полимера. При этом хитозановое покрытие является высоко емкой матрицей-носителем распознающих молекул. Это успешно продемонстрировано на предварительном импрегнировании ионов меди(II) в плазмонный композит с последующим комплексообразованием ионов меди(II), 4-аминоантипирина с биогенным катехоламином – дофамином в окрашенный комплекс. Разработанная индикаторная система позволила повысить скорость реакции в 30 раз, а чувствительность анализа за счет реализации резонансного гигантского комбинационного рассеяния улучшить на три порядка величины и провести анализ на портативном рамановском спектрометре (532 и 638 нм). Предложенные многокомпонентные материалы выступают основой для разработки сенсорных элементов, позволяющих проводить высоко чувствительное определение широкого класса аналитов. Синтезирована тонокопленочная безреагентная плазмонная сенсорная система на основе цинкового фталоцианина и наночастиц серебра, которая совмещает в себе преимущества светоиндуцированной генерации синглетного кислорода при облучении светом в видимой области и сверхчувствительного метода ГКР. В качестве модельного в работе использовали широко распространенный в коммерческих сенсорах субстрат 3,3',5,5’-тетраметилбензидин (ТМБ), так как образующаяся в результате его одноэлектронного окисления форма проявляет высокую плазмонную активность. Подобная сенсорная система позволила детектировать распространенный в коммерческих сенсорах субстрат 3,3',5,5’-тетраметилбензидин в концентрации 5×10-7 М за счет получения продукта его одноэлектронного окисления, высокоактивного в рамановском спектре, путем облучения светом с длиной волны 600-700 нм без добавления окислителей извне. Свет красного и ближнего инфракрасного диапазона обладает меньшей токсичностью, что является преимуществом для анализа ex и in vivо. Последний факт также обеспечивает перспективность предложенной индикаторной системы для работы с биообъектами.