Исследование регуляции транскрипции ВИЧ-1 белком человека Ku и поиск клеточных факторов, участвующих в Ku-опосредованной регуляции транскрипции, с использованием методов секвенирования РНК нового поколенияНИР

The study of the HIV-1 transcription regulation by the human Ku protein and the search for cellular factors that take part in the Ku-mediated transcription regulation using RNA deep sequencing approaches

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 24 апреля 2017 г.-15 декабря 2017 г. Исследование влияния белка Ku на эффективность транскрипции с вирусного промотора в репортерной системе
Результаты этапа: За 2017 год были получены принципиально новые результаты о влиянии человеческого белка Ku на эффективность транскрипции с промотора LTR ВИЧ-1. На основании этих результатов высказана гиротеза, что в отсутствии Tat белок Ku является активатором транскрипции с промотора LTR, хотя его активирующий эффект значительно слабее, чем эффект Tat. В присутствии Tat наблюдается конкуренция между двумя активаторами. Такая модель взаимодействия белка Ku с промотором LTR предлагается впервые. 1. На основе вектора pGL3, содержащего ген люциферазы светлячка, сконструирована система репортерных конструкций для детекции влияния внутриклеточной концентрации белков Ku70 и Ku80 на транскрипционную активность. В качестве основного, получен вектор, в которых ген люциферазы контролируется промотором ВИЧ-1, находящимся в его длинном концевом повторе (pGL3_LTR_HIV). Для нормировки данных, полученных для промотора LTR ВИЧ-1, получена конструкция pGL3_hPGK, с встроенным промотором фосфоглицерат-киназы 1 человека, поскольку для этого промотора ранее была показано, что Ku не влияет на его активность, и конструкция pGL3_CMV, с промотором цитомегаловируса, так как для этого промотора описано подавляющее влияние DNA-PK на его активность. Помимо этого, в векторе pRL_CMV, кодирующем люциферазу Renilla, промотор CMV заменен на промотор hPGK, поскольку, по нашим предварительным данным, этот конститутивный промотор является более удобным контролем в наших условиях. Учитывая, что люциферазу Renilla можно детектировать в одном растворе с люциферазой светлячка, этот вектор является контролем эффективности трансфекции клеток и подготовки препаратов для анализа в системе Dual Luciferase. Таким образом, в отчетном году были получены и протестированы следующие репортерные конструкции: pGL3_LTR, pGL3-CMV, pGL3_hPGK, pRL_hPGK. Все конструкции эффективно поддерживали экспрессию люциферазы при тестировании их активности на культуре клеток HEK 293T. 2. При временном нокдауне обеих субъединиц Ku в клетках линии НЕК 293Т наблюдалось значительное, причем независимое от промотора, уменьшение уровня экспрессии люциферазы. Очевидно, это связано со стрессом, который испытывают клетки из-за большого недостатка Ku70/Ku80. По этой причине влияние одновременного нокдауна обеих субъединиц Ku в дальнейшем не рассматривалось. Подавление каталитической активности DNA-PKcs коммерчески-доступным ингибитором ее каталитической активности приводило к незначительному повышению уровня экспрессии люциферазы со всех промоторов в равной степени, что говорит о неспецифическом влиянии ингибирования DNA-PKcs на транскрипцию. В связи с этим дальнейших экспериментов с DNA-PKcs не проводилось. Для промотора LTR ВИЧ-1 наблюдается значительно более сильная, чем для других промоторов, активация экспрессии люциферазы при суперэкспрессии отдельной субъединицы Ku80 и всего гетеродимера. Ответ на суперэкспрессию субъединицы Ku70 незначительный. Нокаут субъединиц Ku снижает уровень транскрипции со всех промоторов, но негативный эффект от отсутствия Ku значительно более выражен для промотора LTR, причем нокаут ku80 приводит к более сильному падению уровня транскрипции. Таким образом, для промотора LTR показан специфический эффект от изменения внутриклеточного уровня Ku, более сильно выраженный, чем для других промоторов. Активации инициации транскрипции с промотора LTR под действием TNF-α происходит независимо от уровня Ku в клетках, но негативный эффект нокаута Ku на транскрипцию при этом сохраняется. Следовательно, эффект Ku на транскрипцию с LTR промотора не связан со стадией инициации транскрипции. По предварительным данным, при суперэкспрессии белка Tat, который является активатором элонгации транскрипции ВИЧ-1, активация транскрипции в клетках НЕК 293Т дикого типа происходит несколько слабее, чем в клетках, нокаутных по ku70 и ku80, в результате эффективность транскрипции с LTR промотора во всех клетках выравнивается. Возможно, существует конкурирующий механизм активации транскрипции с LTR промотора для Tat и Ku: в отсутствии Tat активация осуществляется по Ku-зависимому пути, в отсутствие Ku по Tat-зависимому, а при наличии обоих белков происходит их конкуренция и снижение эффективности активации. 3. Результаты о характере влияния пониженной/повышенной внутриклеточной концентрации белков Ku70 и Ku80 на транскрипционную активность промотора LTR ВИЧ-1 в составе репортерной конструкции на клеточной линии Jurkat в целом коррелируют с результатами, полученными на клетках НЕК 293Т. Снижение уровня Ku70 с помощью siРНК приводит к снижению экспрессии люциферазы с промотора LTR примерно на 30%. Добавление siРНК к Ku80 также снижает эффективность транскрипции c промотора LTR, хотя эффект менее выражен. Суперэкспрессия субъединиц Ku70 и Ku80 как по отдельности, так вместе приводит к тому, что уровень транскрипции с промотора LTR возрастает примерно в два раза по сравнению с базальным уровнем. Суперэкспрессия вирусного трансактиватора Tat в клетках Jurkat приводит к 20-кратному повышению уровня экспрессии люциферазы. Однако, суперэкспрессия Tat параллельно с суперэкспрессией Ku80 или гетеродимера Ku приводит к значительно меньшей активации экспрессии люциферазы, чем при нормальном уровне Ku. 4. Для получения линий клеток НЕК 293Т, нокаутных по гену белков Ku70, Ku80 и DNA-PKcs, использовалась технология CRISPR/Cas9. Для облегчения отбора нокаутных клеток в разрезаемый Cas9 участок ДНК встраивался ген репортерного флуоресцентного белка (GFP или RFP). Для дизайна гидовой РНК выбирали область гена, наиболее близкую к старт-кодону, чтобы более эффективно инактивировать экспрессию целевого гена. В результате получены линии, нокаутные по генам ku70 и ku80: CrKO_ku70, CrKO_ku80, в которых уровень указанных белков снижен не менее, чем на 50%. При получении линии с нокаутом гена белка DNA-PKcs возникли проблемы с дизайном гидовой РНК, поэтому эта линии еще не получена, хотя по предварительным данным, встраивание гена зеленого флуоресцентного белка прошло успешно.
2 1 января 2018 г.-15 декабря 2018 г. Получение клеточных линий с нокаутом генов белков-компонентов ДНК-зависимой протеин-киназы
Результаты этапа: 1. Проведение работы на клетках J-Lat оказалось крайне затруднительным из-за очень низкой степени трансфекции этих клеток. В этой связи для исследования влияния уровня внутриклеточной концентрации белков Ku70, Ku80, DNA-PKcs на транскрипцию со стабильно интегрированного провируса мы решили создать линию клеток НЕК 293Т с несколькими копиями интегрированного провируса. Для этого впервые была получена конструкция на основе эукариотического вектора pUCHR-inGFPt, содержащая ген люциферазы светлячка под контролем полноразмерного 5’-LTR-промотора ВИЧ-1, фланкированный 3’-конца сигналом полиаденилирования BGH (бычий гормон роста). С целью облегчения нормировки результатов, а также обеспечения простой селекции клеток, содержащих интегрированный провирус, в вектор дополнительно вставлены гены люциферазы Renilla и GFP под контролем промотора hPGK (фосфоглицераткиназы человека), транскрипция с которого, как мы показали в 2017 г., не зависит от уровня Ku70 и Ku80 в клетке. В настоящий момент в результате трансдукции НЕК 293Т этим вектором получены позитивные по всем трем репортерным белкам клетки, которые в ближайшее время будут отсортированы по GFP и охарактеризованы. Эффективность экспрессии люциферазы светлячка в полученных клетках позволяет проводить достоверные эксперименты по оценке уровня белков Ku70 и Ku80 на транскрипцию с LTR промотора. 2. С целью проверки выдвинутой по результатам выполнения проекта в 2017 г. гипотезы о конкурентном механизме активации транскрипции белками Ku и Tat за счет их взаимодействия с TAR РНК, получены репортерные системы на основе вектора pGL3_LTR_HIV, в которых удалена область, кодирующая последовательность TAR (dTAR), или эта последовательность «испорчена» таким образом, что хуже связывается с Ku (mTAR). Проверка эффективности транскрипции со всех полученных векторов в клетках НЕК 293Т, а также в линиях на основе НЕК с моноаллельным нокаутом каждого из компонентов DNA-PK: Ku70, Ku80 и DNA-PKcs показала, что независимо от структуры LTR промотора нокаут гена белка Ku70 снижал уровень экспрессии люциферазы светлячка, а нокаут Ku80 и DNA-PKcs не оказывал значимого влияния. Таким образом, мы установили, что негативный эффект белка Ku70 на транскрипцию с LTR промотора не является TAR зависимым. Следовательно, взаимное негативное влияние белков Tat и Ku70 при активации транскрипции с LTR промотора нельзя объяснить их конкуренцией за связывание с TAR РНК и необходимо более детально проанализировать взаимодействие Ku с другими участниками этапа элонгации транскрипции с промотора ВИЧ, в первую очередь с компонентами комплекса 7SK RNP: 7SK РНК и белками HEXIM1 and Cdk9. 3. Нами разработаны конкретные протоколы получения стабильных нокаутов по генам белков комплекса DNA-PK в клетках линии НЕК 293Т. Для облегчения отбора нокаутных клеток в разрезаемый Cas9 участок ДНК встраивался ген репортерного флуоресцентного белка (GFP). Для дизайна гидовой РНК выбирали область гена, наиболее близкую к старт-кодону, чтобы более эффективно инактивировать экспрессию целевого гена. В результате отбора и анализа клонов получены линии c моноаллельным нокаутом генов белков Ku70, Ku80, DNA-PKcs. Клетки с полным нокаутом этих генов не выживают после сортировки, очевидно, в связи с тем, что эти белки необходимы для реализации жизненно важных для клетки процессов. Помимо этого, была проведена оптимизация получения нокаутных линий клеток путем использования нового маркерного эпитопа, экспрессирующегося на поверхности клетки в контексте GPI-белка CD52. Для этого путем котрансфекции клеток НЕК 293Т компонентами CRISPR/Cas9 и донорской ДНК производили нокин короткой оригинальной конструкции на основе GPI-белка CD52 со встроенным эпитопным тагом HA (CD5HA2). Методика была отработана на гене белка Ku70 и в дальнейшем будет использована для генов белков Ku80 и DNA-PKcs. Что касается получения нокаутных линий на основе CD4+ Т-клеток человека (СЕМ и Jurkat), то эта работа не увенчалась успехом. В случае СЕМ нам удалось отобрать клетки с нокином, но все они погибли через несколько дней инкубации, В случае Jurkat выживаемость клеток оказалась еще ниже. Вероятно, Ku70 в Т-клетках играет более важную роль, чем в клетках 293Т, и снижение уровня его экспрессии приводит в гибели или, по крайней мере, к существенному замедлению роста клеток. Все это препятствует созданию и селекции генетических нокдаунов по Ku70 в лимфоидных клетках человека. 4. Выделены фракции тотальной РНК из 7 типов образцов с разными внутриклеточными концентрациями белков Ku70, Ku80 и DNA-PKcs в трех технических повторностях (всего 21 образец). Подготовлены библиотеки для секвенирования на приборе Illumina HiSeq. Получены сырые данные по тотальной экспрессии РНК для 21 образца в формате fastq. 5. Завершен процессинг сырых данных для последующего анализа дифференциальной экспрессии генов в образцах с разными внутриклеточными концентрациями компонентов DNA-PK. Задержка с определением генов-мишеней, транскрипция которых регулируется белком Ku, вызвана прекращением выпуска набора реагентов для деплеции рибосомальных РНК производства Illumina. Мы перешли на наборы реагентов для деплеции рибосомальной РНК (NEBNext rRNA Depletion Kit), синтеза библиотек (NEBNext Ultra II Directional RNA library Prep kit for Illumina) производства New England Biolabs, что потребовало дополнительного времени на оптимизацию условий фрагментации РНК, рибодеплеции и получения библиотек. 6. Дополнительно к запланированным результатам, впервые разработан метод, на основе количественной ПЦР, позволяющий определить эффективность репарации повреждений в геноме клетки, возникающих в результате интеграции вирусной ДНК. С помощью этого метода впервые доказано, что эффективная транскрипция с интегрированного провируса действительно происходит только после репарации повреждений в геноме. Также впервые установлено, что уровень постинтеграционной репарации существенно (в 2-4 раза) понижен в клетках со сниженным уровнем любого из компонентов DNA-PK: Ku70, Ku80, DNA-PKcs. Этот факт ранее никогда не учитывался при изучении влияния компонентов DNA-PK на транскрипцию ВИЧ-1.
3 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Выяснение механизма влияния Ku на активацию транскрипции с промотора ВИЧ-1
Результаты этапа: 1. Выяснение возможности взаимодействия белка Ku с 7SK РНК и с белками HEXIM1 и Cdk9 в клетках НЕК 293Т с целью определения механизма выявленного нами влияния Ku на активацию элонгации транскрипции с промотора ВИЧ-1. Установлено, что белок Ku взаимодействует с 7SK РНК, причем связывание показано как для рекомбинантного белка и Т7 транскрипта РНК, так и для эндогенной 7SK РНК и белка, суперэкспрессированного в клетках НЕК 293Т. Методом футпринтинга показано, что Ku преимущественно связывается с терминальной петлей 1-ой шпильки РНК. Методом иммунопреципитации обнаружено, что Ku взаимодействует с главной 42-кДа изоформой Cdk9 в клетках НЕК 293Т, причем это взаимодействие не зависит от наличия РНК. В то же время установлено, что с белком HEXIM1 Ku непосредственно связываться не может, но возможно образование тройного комплекса HEXIM1, Ku и 7SK РНК. Таким образом, можно сделать вывод о том, что Ku взаимодействует с 7SK РНК, а также белками 7SK мяРНП, в первую очередь с Cdk9. Методом иммунопреципитации хроматина показано, что Ku ассоциирован с промотором ВИЧ-1. Возможно, Ku привлекается на промотор в составе 7SK мяРНП, и в этом заключается функциональная роль их взаимодействия. 2. Оценка влияния белков Ku70, Ku80 и DNA-PKcs на транскрипцию с промотора ВИЧ-1 при первичном акте заражения клетки с использованием лентивирусного вектора, кодирующего гены трех репортерных белков. Исследование влияния белков комплекса DNA-PK на ранние стадии репликативного цикла ВИЧ-1 позволило нам впервые показать, что уровень постинтеграционной репарации существенно (в 2-4 раза) понижен в клетках со сниженным уровнем любого из компонентов DNA-PK. Помимо этого, мы показали, что транскрипция с LTR промотора происходит только после репарации повреждений, возникающих при интеграции вирусной кДНК в геном клетки. Соответственно, мы пока не стали исследовать влияние Ku на транскрипцию при первичном акте заражения клетки с использованием лентивирусного вектора, поскольку при этом невозможно оценить влияние компонентов DNA-PK именно на транскрипцию. В настоящее время мы разрабатываем подход, который позволит это сделать. 3. Определение влияния белков Ku70, Ku80 и DNA-PKcs на транскрипцию латентно-интегрированного провируса в полученной нами клеточной линии на основе HEK 293T. Установлено, что повышение уровня как Ku70, так и Ku80 стимулирует экспрессию люциферазы с интегрированного провируса, а снижение внутриклеточной концентрации этих белков понижает уровень экспрессии этого репортерного белка. Таким образом, мы можем сделать вывод о том, что обе субъединицы гетеродимера Ku являются позитивными факторами для экспрессии генов интегрированного провируса, в то время как DNA-PKcs не оказывает значительного влияния. 4. Получение списка генов, экспрессия которых регулируется гетеродимером Ku, на основании анализа данных RNAseq. 5. Валидация генов, экспрессия которых регулируется гетеродимером Ku путем оценки изменения количества соответствующих мРНК при изменении уровня белка Ku и его отдельных субъединиц в клетках линии НЕК 293Т методом количественной ПЦР.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".