Исследование механизмов влияния белка человека Ku70 на стабильность интегразы ВИЧ-1 в клеткахНИР

Evaluation of the mechanisms of influence of the human Ku70 protein on the HIV-1 integrase stability in the cell

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 5 апреля 2017 г.-15 декабря 2017 г. Оценка влияния разных внутриклеточных концентраций Ku70 на динамические и равновесные концентрации интегразы
Результаты этапа: 1. В ходе выполнения первого этапа работы получены конструкции для эукариотической экспрессии ИН дикого типа (ИН-wt) и ИН, в которой аминокислотные остатки E212 и L213 заменены на аланин (ИН-mut), для которой в эксперименте in vitro ранее было показано, что она не формирует стабильный комплекс с Ku70. 2. Для того чтобы оценить вклад в деградацию ИН N-концевого правила деградации белков, налажена система эукариотической экспрессии ИН, несущей на N-конце дестабилизирующую аминокислоту фенилаланин (как в ИН, кодируемой вирусным геномом) (Phe-ИН), со специально полученной конструкции, в которой ИН закодирована в составе единого полипептида с вирусной протеазой. Установлено, что Phe-ИН крайне нестабильна в клеточной культуре, однако время ее жизни несколько увеличивается при повышении внутриклеточного уровня Ku70. 3. Исследовано взаимодействие Ku70 с ИН-wt и ИН-mut в клетках и показано, что Ku70 эффективно соосаждается с ИН-wt, но не взаимодействует с ИН-mut. Вместе с тем, эксперименты по определению влияния различных внутриклеточных концентраций Ku70 на равновесные концентрации ИН-wt и ИН-mut в трех клеточных линиях показали, что при одинаковом уровне Ku70 время полужизни обеих интеграз практически одинаково. 4. Аналогичная зависимость обнаружена и при изучении влияния уровня Ku70 в клетке на динамические (в условиях ингибирования трансляции циклогексимидом) концентрации ИН-wt и ИН-mut. Оказалось, что стабильность обоих белков принципиально зависит от уровня Ku70: повышение уровня Ku70 ведет к стабилизации ИН, понижение уровня Ku70 – к увеличению скорости ее деградации, однако время полужизни обеих интеграз при одинаковом уровне Ku70 одинаково. Тот факт, что мутантная форма ИН, неспособная напрямую взаимодействовать с Ku70, проявляла аналогичные ИН_wt свойства, показывает, что, скорее всего, эффект Ku70 вызван не его непосредственным взаимодействием с интегразой, а осуществляется через деубиквитинилирование интегразы.
2 1 января 2018 г.-30 декабря 2018 г. Характеристика влияния различных внутриклеточных концентраций делеционных мутантов Ku70 на стабильность ИН ВИЧ-1
Результаты этапа: Установлено, что повышение внутриклеточной концентрации делеционного мутанта Ku70(1-250) стабилизирует оба варианта ИН ВИЧ-1 (ИН_wt и ИН_mut) в клетках НЕК 239Т, а мутант Ku70(439-609)не влияет на стабильность ИН. Более того, повышение внутриклеточной концентрации делеционного мутанта Ku70(1-250)снижало эффективность репликации псевдовируса на основе ВИЧ-1, очевидно за счет того, что суперэкспрессированный мутантный белок мешал ИН взаимодействовать с эндогенным белком Ku70. Изменение внутриклеточной концентрации Ku70 не влияло на соосаждение 20S протеасомы с ИН ВИЧ-1.
3 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Проверка способности полноразмерного белка Ku70 и его делеционных мутантов деубиквитинилировать ИН ВИЧ-1
Результаты этапа: 1. Охарактеризовано влияние различных доменов Ku70 на внутриклеточную стабильность ИН ВИЧ-1. 2. Получена характеристика влияния различных внутриклеточных концентраций Ku70 на уровень убиквитинилирования ИН ВИЧ-1. 3. Показана способность белка Ku70 деубиквитинилировать ИН ВИЧ-1 в условиях in vitro. 4. Исследован механизм стабилизирующего эффекта белка Ku70 по отношению к ИН ВИЧ-1.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".