ИСТИНА

Одним из наиболее распространенных видов рака среди мужчин является рак предстательной железы (РПЖ). Хорошо зарекомендовавшим себя белковым маркером данного заболевания является простатический специфический мембранный антиген (ПСМА). Его экспрессия на порядки повышается в патологических клетках по сравнению со здоровыми. Из существующих ингибиторов ПСМА, наибольшее распространение получили лиганды на основе мочевины [1, 2]. Смертность больных раком предстательной железы все чаще связывают не с первичной опухолью, а с сопутствующим метастатическим заболеванием. Таким образом, метастазы напрямую влияют на прогноз и клинический исход заболевания. Поэтому их диагностика также играет важную роль в течении заболевания. В настоящее время существуют 2 основных подхода к диагностике онкологических опухолей: 1) использование радионуклидов; 2) использование флуоресцентных красителей. Среди радиофармпрепаратов некоторые уже проходят клинические испытания, а, например, [68Ga]-PSMA-11 уже одобрен FDA. Однако, при использовании радиофармпрепаратов проявляется ряд недостатков, связанных с получением, хранением и временем жизни радионуклидов, а также с продуктами их распада. Использование флуоресцентных красителей является альтернативным методом визуализации злокачественных новообразований, поскольку к их преимуществам относится: длительность хранения, скорость обнаружения, отсутствие радиоактивности, низкая дозировка. Биологическая совместимость флуоресцентных красителей хорошо доказана, например, наиболее известный карбоцианиновый краситель – индоцианиновый зеленый (ICG) – одобрен FDA и широко используется в клинической практике для оптической визуализации, в том числе для ангиографии [3], для визуализации лимфатической, билиарной и кишечной систем и как визуализатор в стоматологии и в онкологической хирургии [4]. В процессе интраоперационной резекции опухоли хирургам необходимо точно знать ее локализацию, что является важной и сложной задачей. Если удалить злокачественное новообразование не полностью, это может снизить эффективность проводимого хирургического вмешательства и привести к рецидиву заболевания. В качестве окрашивающих препаратов зачастую используются флуоресцентные красители, благодаря вышеописанным преимуществам. От структуры флуорофора зависят спектральные характеристики, позволяющие регистрировать состояние системы и локализацию объекта визуализации в ходе диагностики (в случае гистологических исследований) и операций. Уникальные фотофизические свойства карбоцианинов в различных средах и широком диапазоне длин волн поглощения и флуоресценции привели к их использованию в самых разнообразных областях аналитической химии, биологии и медицины для количественного мониторинга процессов в тканях in vitro, ex vivo и in vivo. Проблема и недостаток описанных в литературе конъюгатов с карбоцианинами, направленных на РПЖ, заключается в том, что основной упор на модификацию и улучшение структуры конъюгатов направлен на варьирование и оптимизацию структуры векторного фрагмента. Однако, большое влияние на свойства всей молекулы, может оказать и структура карбоцианина. Описаны случаи, когда при конъюгировании лиганда с высокими показателями сродства (Ki = 10 - 15 нМ) и хорошо зарекомендовавшей себя флуоресцентной меткой, на выходе получался конъюгат с молярными значениями константы ингибирования (Ki = 700 нМ) [5]. Как правило, в таких случаях авторы полностью меняют либо структуру лиганда, либо берут другую коммерчески доступную метку. Таким образом, происходит ограничение в применении уже разработанных лигандов и целых классов карбоцианинов, в то время как решение проблемы может скрываться, например, в недостаточной растворимости конъюгата или в стерических взаимодействиях, которые можно скорректировать за счет структуры метки. На сегодняшний день проведено недостаточно исследований соотношения структура активность между строением флуоресцентной метки на основе карбоцианина и сродством (а также спектральными и физико-химическими характеристиками) конъюгатов к ПСМА.

Surgical resection of malignant neoplasms is one of the effective ways to fight prostate cancer, one of the leading types of cancer among men. The efficiency of intraoperative diagnostics in this case is of fundamental importance, because otherwise part of the tumor tissues can remain, which can lead to recurrence. Tumor visualization is performed using fluorescent dyes conjugated with selectively targeting target protein molecule. In the case of prostate cancer (PCa), the target protein is prostate specific membrane antigen (PSMA). Urea-based low-molecular-weight inhibitors have been widely used as vector-directed PSMA molecules. The introduction of dipeptides into the linker structure of PSMA conjugates has a positive effect on the biological activity of the whole molecule. Based on previous studies, a PSMA inhibitor ligand with a dipeptide structure based on phenylalanine and tyrosine will be taken as the basis of the vector system. On their basis, conjugates with such fluorescent dyes as 800CW, ICG, Cy7, Cy5.5, etc. are being developed. It is worth noting that ICG (indocyanine green) is FDA-approved and used in clinical practice in many areas. However, a disadvantage of the works performed is that there is no systematic choice of the fluorescent tags used, and the resulting conjugates do not always show high affinity to PSMA. The project aims to investigate the structure-activity relationship between the introduction of certain functional groups into the structure of carbocyanines and the affinity to PSMA. This will help facilitate the selection of fluorescent dyes when creating new PSMA fluorescent conjugates for histology kits and intraoperative imaging tools. It is also worth noting that there are no commercially available registered diagnostic conjugates with carbocyanines against PSMA in Russia, which is a significant gap.

Будет проведена разработка и описание методик синтеза модифицированных карбоцианинов и лигандов ПСМА, готовых для дальнейшего конъюгирования. Полученные соединения будут описаны с помощью методов физико- химического анализа 1H ЯМР, 13C ЯМР, HRMS, ВЭЖХ). Планируется получить не менее 5 флуоресцентных красителей и 2 лигандов, модифицированных для реакций пептидного синтеза и азид-алкинового присоединения. Будет проведено описание методики получения диагностического конъюгата и подтверждение его структуры.

В рамках проведенной работы удалось достичь следующие научные результаты: Была проведена оптимизация методик получения селективно направленных лигандов на простатический специфический мембранный антиген (ПСМА) с терминальной азидо-группой и с терминальной амино-группой. За основу была взята структура мета-хлор замещенный ароматический фрагмент при атоме азота лизина и дипептидной цепочкой в структуре линкера L-Phe-L-Tyr. В частности, была оптимизирована методика удаления t-Bu защитных групп с целевых лигандов при одновременном удалении его с полимерного носителя. Таким образом, было получено 4 лиганда селективно направленных на простатический специфический мембранный антиген: 3 из которых представляют собой структуру мета-Cl L-Phe-L-Tyr для различных способов конъюгирования: с трет-Bu защитными группами в структуре мочевины и терминальной амино-группой, свободными карбоксильными группами в структуре мочевины и терминальной амино-группой, свободными карбоксильными группами в структуре мочевины и терминальной азидо-группой. Также наработан дополнительный лиганд пара-COOH L-Phe-L-Tyr(3-NO2) со свободными карбоксильными группами в структуре мочевины и терминальной азидо-группой. Разработан подход к созданию структурных модификаций карбоцианинов, содержащих алкильную группу для реакции азид-алкинового циклоприсодинения. Впервые синтезированы асимметричные дикарбоцианиновые флуорофоры, содержащий комбинацию различных гетероциклических ядер (индолениниевого, бензидолениниевого и бензотиазольного), связанных полиметиновой цепью и имеющих различные заместители при кватернизованных атомах азота, один из которых выполняет удобную функцию для ковалентного связывания. Была синтезирована, выделена и охарактеризована серия трикарбоцианинов, в которых хлор в мезо-положении замещен на пропаргиламин. Таким образом, было получено 4 трикарбоцианиновых флуорофора, способных вступать в клик-реакцию с ПСМА-лигандами. Методы пептидного синтеза и нуклеофильного присоединения показали низкую эффективность, в результате чего основным способом получения конъюгатов на втором этапе стало азид-алкиновое циклоприсоединение, катализируемое медью. Было показано, что разработанная методика получения конъюгатов реакцией CuAAC хорошо воспроизводима как в плане выходов, так и в плане устойчивости флуорофоров к данным условиям. Оптимизирована методика получения флуоресцентных диагностических конъюгатов путем азид-алкинового циклоприслединения. Проведена очистка с помощью обращенно-фазовой хроматографии. В результате получено 3 серии ранее не описанных диагностических флуоресцентных конъюгатов, структуры которых были установлены основными физико-химических методами. Первая серия представляет собой конъюгаты на основе лиганда с мета-хлор замещенным ароматическим фрагментом при атоме азота лизина и дипептидной цепочкой в структуре линкера L-Phe-L-Tyr и новыми асимметричными флуорофорами. Вторая серия представляет собой 3 конъюгата на основе такого же лиганда, в которых были проварьированы заместители в структуре индоленина. Третья серия представляет собой 2 новых конъюгата с хромофором BODIPY, но различными векторными фрагментами. В дополнение к вышеуказанному лиганду был взят лиганд с пара-карбокси замещенным ароматическим фрагментом при атоме азота лизина и дипептидной цепочкой в структуре линкера L-Phe-L-Tyr-(3-NO2). Были исследованы фотофизические свойства как флуорофоров, так и конъюгатов на их основе. Было показано, что введение в структуру триазольного кольца в непосредственной близости от пентаметинового красителя в заместителе у кватернизированного атома азота или флуорофора на основе BODIPY не влияет на фотофизические свойства флуорофоров и конъюгатов, на их основе, сохраняя свои характеристики. Было установлено, что замещение атома хлора пропаргил амином, где атом азота входит в сопряжение с полиметиновой цепью исходных флуорофоров приводит к большому гипсохромному сдвигу максимумов поглощения (≈140 нм) и флуоресценции (≈ 40 нм). При этом введение в структуру ПСМА-лиганда и наличие триазольного кольца вблизи к сопряженной системе никак не влияет на эти показатели. Было показано, что наличие пропаргиламина в структуре трикарбоцианина увеличивает квантовый выход флуоресценции. Наиболее выдающийся результат дали молекулы с суммарно положительным и нейтральным зарядом молекулы, Φfl увеличился более чем в 2 раза. А введение лиганда увеличило показатель квантового выхода флуоресценции более чем в 20 раз. Краситель на основе BODIPY и конъюгата на его основе показали, что квантовый выход флуоресценции увеличивается в 10 раз по сравнению с пентаметиновыми и гептаметиновыми флуорофорами и конъюгатами на их основе. Было показано, что введение триазольного кольца даже через одну метиленовую группу уже дает сильное влияние на фотофизические свойства конъюгатов на основе трикарбоцианинов. Было проведено исследование липофильности конъюгатов в системе октанол-вода. Была доказана возможность изменения свойств растворимости конъюгата путем варьирования алкилсульфотатных и карбоэтоксиалкильных заместителей в структуре трикарбоцианинов. С увеличением количества сульфонатных групп возрастает гидрофильность молекулы, присоединение вектора в целом увеличивает липофильность конъюгатов. В результате проведенных исследований in vitro была продемонстрирована селективность конъюгата на основе несимметричного флуорофора к клеткам рака предстательной железы, при этом не модифицированный флуорофор не обладает селективностью к ПСМА-экспрессирующим клеткам. Конъюгат с хромофорам BODIPY также показал специфичность относительно клеточных линий LNCaP и 22Rv1, однако, уступает по накоплению конъюгатам с карбоцианинами в структуре которых имеются сульфонатные группы. Таким образом, можно сделать вывод о том, что в структуру флуорофора целесообразно вводить сульфонатные группы, при этом значительной разницы в липофильности и специфичности к ПСМА в зависимости от их количества не наблюдалось. Всего за время выполнения проекта было получено 14 карбоцианиновых красителей из них 5 флуорофора для создания конъюгатов с помощью нуклеофильного замещения, 3 красителя для пептидного синтеза и 6 для осуществления клик-реакции с лигандами; 4 лиганда селективных к ПСМА из них 3 на основе мета-Cl-PSMA-L-Phe-L-Tyr, отличные модификациями под типы конъюгирования и 1 на основе пара-COOH-PSMA-L-Phe-L-Tyr-(3-NO2); 3 диагностических конъюгата из них 1 получен двумя способами пептидного синтеза, 1 получен по новой методике нуклеофильного замещения. По итогу было получено 7 конъюгатов реакцией азид-алкинового циклоприсоединения: 2 на основе несимметричных дикарбоцианиновых флуорофоров, содержащих сочетание разных гетероциклических ядер, 3 на основе трикарбоцианинов, содержащих в своей структуре либо алкилсульфотатные, либо с карбоэтоксиалкильные заместители и модифицированные алкинильной функцией по мезо-положению полиметиновой цепи, 2 конъюгата с хромофором на основе BODIPY с различными векторными платформами, селективно направленными на рак предстательной железы. Результаты проделанной работы были опубликованы в следующих статьях: 1. Uspenskaia, A. A., Doroshenko, I. A., Popovicheva, K. A., Shmychkov, N. V., Pryakhina, E. V., Shafikov, R. R., Skvortsov, D. A., Beklemishev, M. K., Zaborova, O. V., Podrugina, T. A., Machulkin, A. E., and Beloglazkina, E. K. (2025) Pentamethine cyanine dyes with alkynyl group as perspective structure for conjugation with targeting moiety. Bioorg. Med. Chem. Lett. 115, 130025. 2. Успенская А.А., Дорошенко И.А., Поповичева К.А., Шмычков Н.В., Левина И.И., Беклемишев М.К., Ташлицкий В.Н., Подругина Т.А., Мачулкин А.Э., Белоглазкина Е.К. Fluorescent conjugates with aminocyanine dyes: synthetic approaches and photochemical properties Mendeleev Communications (2024) (Статья принята в печать – справка загружена в личный кабинет отчета) 3. Fluorescent conjugates based on prostate-specific membrane antigen ligands as an effective visualization tool for prostate cancer / A. A. Uspenskaia, P. A. Krasnikov, E. K. Beloglazkina, A. E. Machulkin // Biochemistry (Moscow). — 2023. — Vol. 88, no. 7. — P. 953–967. (doi: 10.1134/S0006297923070088) На русском: ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ КОНЪЮГАТЫ НА ОСНОВЕ ЛИГАНДОВ ПРОСТАТИЧЕСКОГО СПЕЦИФИЧЕСКОГО МЕМБРАННОГО АНТИГЕНА КАК ЭФФЕКТИВНОЕ СРЕДСТВО ВИЗУАЛИЗАЦИИ ОПУХОЛЕЙ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ / А. А. УСПЕНСКАЯ, П. А. КРАСНИКОВ, А. Г. МАЖУГА и др. // Биохимия. — 2023. — Т. 88, № 7. — С. 1173–1190 (doi: 10.31857/S0320972523070084) Результаты проделанной работы были представлены на конференциях: 1. Стендовый доклад Успенская А.А., Поповичева К.А., Зык Н.Ю., Скворцов Д.А., Шафиков Р.Р., Шмычков Н.В., Дорошенко И.А., Мачулкин А.Э. с названием "СИНТЕЗ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ КОНЪЮГАТОВ НА ОСНОВЕ ЛИГАНДОВ ПРОСТАТИЧЕСКОГО СПЕЦИФИЧЕСКОГО МЕМБРАННОГО АНТИГЕНА" был сделан на конференции: "XXII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии" Университет «Сириус», Российская Федерация, 7-11 октября 2024 2. Устный доклад Дорошенко И.А., Успенская A.A., Мачулкин А.Э., Подругина Т.А.с названием «Синтетический дизайн конъюгатов на основе карбоцианиновых красителей для визуализации клеточных процессов» был сделан на конференции «Международной конференции по химии «Байкальские чтения-2023», Иркутск, Российская Федерация, 4-8 сентября 2023