![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ПсковГУ |
||
Представленный проект направлен на изучение системы флавинилирования, ковалентно пришивающей остаток FMN к различным белкам, у разнообразных микроорганизмов. В ходе выполнения проекта будет проведено исследование функциональной роли ApbE-подобных белков как у про-, так и у эукариот. В частности будет установлена роль ApbE-подобного домена в функционировании водорастворимой NADH:фумарат оксидоредуктазы кинетопластид. Также будет произведена идентификация FAD-экспортирующего белка у бактерий, содержащих Na+-транслоцирующую NADH:хинон оксидоредуктазу (NQR), и проведено определение роли экспорта флавинов из бактериальной клетки в процессе созревания NQR и других FMN-содержащих белков. Анализ распространения системы флавинилирования среди микроорганизмов, а также функциональное изучение некоторых, наиболее интересных ее представителей позволит определить новые, еще неизвестные FMN-содержащие белки и (или) выявить новые функции этой системы, а также установить роль экспорта FAD из бактериальных клеток в жизнедеятельности этих микроорганизмов.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 25 апреля 2017 г.-31 декабря 2017 г. | Исследование молекулярных механизмов флавинилирования белков у микроорганизмов |
Результаты этапа: В 2017 году в ходе выполнения проекта исследована гликосомальная форма NADH:фумарат оксидоредуктазы (FRD) из простейшего Leptomonas pyrrhocoris. Один из трех доменов этого белка гомологичен бактериальным белкам ApbE, осуществляющих ковалентное присоединение остатка FMN к остаткам треонина некоторых бактериальных флавобелков. Белок FRD был продуцирован в клетках дрожжей и выделен с помощью аффинной хроматографии. Показано, что очищенный белок способен к катализу NADH:фумарат оксидоредуктазной реакции и содержит ковалентно связанный флавин, который был определен с помощью масс спектрометрии как остаток FMN. Проведенный анализ показал, что этот флавин ковалентно присоединен к остатку Ser9 мотива флавинилирования D3(g/s)x(s/t)(s/g)AS9 на N-конце белка FRD. Данный мотив присутствует во всех первичных структурах FRD кинетопластид и сходен, но не идентичен с таковым мотивом (Dxx(s/t)gAT), который используется белками ApbE при флавинилировании бактериальных флавобелков. | ||
2 | 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. | Исследование молекулярных механизмов флавинилирования белков у микроорганизмов |
Результаты этапа: В 2017-2018 годах в ходе выполнения проекта исследована гликосомальная форма NADH:фумарат оксидоредуктазы (FRD) из простейшего Leptomonas pyrrhocoris. Один из трех доменов этого белка гомологичен бактериальным белкам ApbE, осуществляющих ковалентное присоединение остатка FMN к остаткам треонина у некоторых бактериальных флавобелков. Белок FRD был продуцирован в клетках дрожжей и выделен с помощью аффинной хроматографии. Показано, что очищенный белок способен к катализу NADH:фумарат оксидоредуктазной реакции и содержит ковалентно связанный флавин, который был определен с помощью масс спектрометрии как остаток FMN. Проведенный анализ показал, что этот флавин ковалентно присоединен к остатку Ser9 мотива флавинилирования D3xx(s/t)(s/g)AS9 на N-конце белка FRD. Замена Ser9 на Asn предотвращала флавинилирование FRD и приводила к полной потере NADH:фумарат оксидоредуктазной активности этим белком. Определенный в ходе выполнения проекта характер флавинилирования FRD является первым экспериментально доказанным примером функционирования флавин трансферазы у эукариот, а также применения остатка серина для ковалентного присоединения флавина. | ||
3 | 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. | Исследование молекулярных механизмов флавинилирования белков у микроорганизмов |
Результаты этапа: В ходе выполнения проекта также показано, что все известные на сегодняшний день флавобелки, содержащие ковалентно связанный с треонином или серином остаток FMN, принадлежат к трем различным структурным классам и содержат в своих последовательностях консервативный мотив, состоящий из семи аминокислотных остатков. Для определения специфичности реакции флавинилирования таких белков мы исследовали эффекты аминокислотных замен в мотиве флавинилирования цитоплазматической фумарат редуктазы из Klebsiella pneumoniae при протекании модификации под действием собственной флавин трансферазы ApbE в рекомбинантных клетках Escherichia coli. Замена модифицируемого остатка треонина на аланин полностью предотвращала флавинилирование, тогда как замены консервативных остатков аспартата и серина приводили лишь к минорным эффектам. Остальные замены, включая замену модифицируемого треонина на серин, сопровождались 10–55% уменьшением степени флавинилирования. Показана значительная роль остатков глицина и аланина мотива флавинилирования в процессе модификации белка-мишени, а также осуществления этим белком ферментативной активности. Также на примере субъединицы NqrC Na+-транслоцирующей NADH:хинон оксидоредуктазы продемонстрировано, что нековалентное связывание изоаллоксазинового кольца FMN не является необходимым условием для протекания реакции флавинилирования. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".