Комплексный анализ экспрессии митохондриального генома жгутиковых простейших отряда KinetoplastidaНИР

Complex analysis of mitochondrial genome expression of unicellular flagellates of the order Kinetoplastida

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 2 августа 2022 г.-30 июня 2023 г. Комплексный анализ экспрессии митохондриального генома жгутиковых простейших отряда Kinetoplastida
Результаты этапа: В результате выполнения проекта были отсеквенированы митохондриальные геномы и транскриптомы Trypanoplasma borreli, Leptomonas seymouri, Wallacemonas sp. WSD и Vickermania ingenoplastis. Была проведена сборка максиколец и полного репертуара миниколец для данных объектов, а также сборка транскриптома с помощью T-Aligner (специального программного обеспечения, разработанного нами для анализа митохондриального транскриптома кинетопластид). Анализ этих данных позволил установить, что в разных филогенетических ветвях дерева семества трипаносоматид обнаруживаются различные паттерны организации миниколец. При этом у родственной трипаносоматидам парабодониды - T. borreli - миниколец не обнаруживается. Гидовые РНК у данного вида расположены на длинных линейных молекулах, по концам которых расположены длинные повторы. Мы предполагаем, что такие молекулы являются эволюционными предшественниками миниколец ассоциата кпДНК.
2 1 июля 2023 г.-30 июня 2024 г. Комплексный анализ экспрессии митохондриального генома жгутиковых простейших отряда Kinetoplastida
Результаты этапа: Среди шести исследуемых в рамках проекта объектов оказались две пары видов из родов Leptomonas и Vickermania, различающиеся временем культивирования в лаборатории. Сравнение их геномов позволило нам продемонстрировать связь длительного лабораторного культивирования с частичной деградацией редактирования генов из-за утраты классов миниколец, кодирующих нужные для редактирования гРНК. Первый и единственный подобный случай был описан в 2015 году для модельного объекта Leishmania tarentolae, когда из природы был выделен новый его штамм. Наши данные свидетельствуют в пользу того, что случаи лабораторной эволюции такого рода могут быть широко распространены, что делает лабораторные культуры (особенно те, что длительное время пассировались) непригодными для изучения функций генома митохондрии. По-видимому, лабораторное культивирование создает условия, в которых нормальная активность ЭТЦ митохондрии не требуется, что убирает действие естественного отбора на ряд генов и в итоге приводит к быстрой утрате части миниколец. Подтверждения данной гипотезы также можно найти в работах, описывающих репликацию кинетопласта - моделирование стохастической сегрегации миниколец показывает возможность быстрой (в течение сотен клеточных делений) утраты части классов миниколец. Нами также исследован уникальный вид Blastocrithidia nonstop, интересный тем, что принадлежит к малоизученной сегрегированной кладе семейства Trypanosomatida. Большое количество генов максикольца митохондрии B. nonstop проявляет черты псевдогенов: высокая дивергенция последовательности от их ортологов в других видах и утрата продуктивного редактирования мРНК. Интересно, что у данного организма не обнаруживается гРНК, редактирующих гены комплекса I дыхательной цепи митохондрий. И здесь следует заметить, что при описании случаев лабораторной эволюции (о которых мы говорили выше), также в большинстве случаев прежде всего страдают гены комплекса I. В случае B. nonstop, однако, имеет место естественный природный процесс. Таким образом, можно предположить, что и в естественной среде обитания трипаносоматиды могут сталкиваться с условиями, когда часть генов митохондрии оказывается не нужной, и генетический аппарат их редактирования деградирует. Дополнительно важнейшим результатом исследования генома B. nonstop стал тот момент, что фактически предсказанная с помощью ПО T-Aligner в результате анализа РНК и геномной ДНК утрата функции комплекса I была подтверждена прямыми биохимическими методами. Подробнее результаты работы можно почитать в статье. Получив свидетельства утраты миниколец и, как следствие, отсутствия продуктивного редактирования части митохондриальных генов у ряда видов, причем из разных филогенетических клад и при разных условиях, мы решили проверить, действует ли естественный отбор на гены максикольца и с какой относительной скоростью эволюционирует его последовательность. Ранее было показано, что миникольца митохондриального генома изменяются крайне быстро, их последовательности могут варьировать даже у штаммов, однако на счет скорости дивергенции максикольца высказывались разные предположения. Нами были анализированы два набора популяционных данных лейшманий Старого и Нового света, в результате анализа нами впервые была измерена относительная скорость изменения максикольца относительно ядерного генома. Также было выявлено действие естественного отбора на все гены максикольца лейшманий, таким образом, показано, что в природных условиях в популяциях разных видов лейшманий гены максикольца (в том числе комплекса I) активно используются. Здесь следует отметить, что в ходе проекта впервые были получены важные ценные сведения о распроспранении в митохондриальном геноме кинетопластид явлений, связанных с утратой функции ряда генов как в естественных условиях, так и в условиях лабораторного выращивания, что несколько изменило наши изначальные научные планы. Так, например, описанное выше исследование отбора и скорости эволюции генома митохондрии мы изначально делать не планировали, оно было выполнено вместо изучения термотолеранстности WSD (более подробное обоснование изменения плана работы было дано в отчете за предыдущий период). Мы считаем, что полученные нами сведения о дейвстии отбора как на гены максикольцевого генома в популяциях лейшманий, так и на миникольцевую компоненту у лабораторных культур и в естественных условиях, позволяют установить критерии для выбора объекта при исследовании системы редактирования и ее эволюционной роли, которыми являются 1. сохранение исходного разнообразия миниколец, 2. активная транскрипция митохондриальных генов, 3. по возможности, короткая история культивирования в лабораторных условиях. Так как Wallacemonas sp. WSD не удовлетворял строго данным критериям, было решено не проводить опыты по термотолераности на данном объекте, несмотря на простоту его транскриптома (см. ниже), которая может быть обусловлена тем, что данный геном не полностью функционален у данного изолята, а следовательно, не подходит для изучения эволюционной роли РНК редактирования. В ходе проекта нами были также изучены митохондриальные геномы еще двух уникальных представителей Kinetoplastida: Wallacemonas sp. WSD из эндосимбионт-содержащей клады и криптобии Trypanoplasma borreli - базальной по отношению к семейству трипаносоматид. Оба генома обладают интересными особенностями. В геноме представителя эндосимбионт-содержащей клады происходит множественная редукция редактируемых доменов ряда генов (ND8, ND7, CO3, A6, CYb) в том смысле, что на максикольце кодируется готовая функциональная открытая рамка считывания гена. Согласовано с этим происходит сильное уменьшение числа классов миниколец, так как резко падает потребность в количестве гРНК. Данный геном является на сегодня самым простым известным геномов по критерию общего количества редактируемых сайтов. Геном криптобии интересен прежде всего тем, что гены гРНК оказываются локализованными на длинных, по-видимому, линейных молекулах. Таким образом, данный геном представляет собой эволюционную стадию, когда классический ассоциат кпДНК (миникольца+максикольца) еще не сформирован, тогда как РНК редактирование уже хорошо работает. Данный геном дает ценный материал для изучения начальных этапов эволюции системы гРНК, которые у современных трипаносоматид находятся на специализированных миникольцах, причем, как мы отмечали в ходе прошлого отчета, можно выделить несколько разных паттернов организации миниколец. Стоит отметить, что максикольцевой геном T. borreli также сильно отличен от "типичного" для трипаносоматид, содержит меньше генов, а расположение редактируемых доменов также является "нетипичным". Подробное описание генома данного вида можно найти в нашей статье. В завершении проекта мы обобщили данные о транскрипции и редактировании для всех изученных нами видов, а также видов, данные для которых были доступны в базах данных или из литературы. В результате сравнительного анализа экспрессии было установлено, что ген RPS12, кодирующий важный для структуры рибосомы белок, выделяется рядом свойств. Он стабильно и относительно на высоком уровне экспрессируется у всех изученных видов, включая криптобию. А его транскрипты всегда активно и полностью редактируются, даже в тех случаях, когда имела место длительная лабораторная эволюция, сопровождающаяся утратой части миниколец. Данный ген, являясь частью рибосомы, по-видимому, нужен клеткам независимо от условий культивирования, поэтому всегда находится под действием отбора и сохраняет способность редактироваться до зрелой мРНК. Эта особенность делает данный ген удобной моделью для изучения эволюции редактирования. Нами были выделены два супер-консервативных участка в мРНК гена RPS12 и проведен детальный анализ редактирования сайтов в пределах этих участков. Данный анализ выявил эволюционные тенденции, характерные для генов трипаносоматид. Во-первых, было показано, что гомологичные и в случае RPS12 очень консервативные сайты мРНК редактируются абсолютно не схожими по структуре и негомологичными генами гРНК. Во-вторых, имеется общая тенденция на сокращение числа редактируемых сайтов. Ранее (в том числе в наших работах) было показано явление редукции длины редактируемого домена, возникающее в результате замещения последовательности гена в геноме на частично отредактированную мРНК в результате обратной транскрипции. На примере RPS12 мы демонстрируем наличие более тонкого эволюционного механизма на уровне отдельных сайтов.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".