Изучение эволюционных изменений в механизмах белок белковых взаимодействий при формировании комплекса пластоцианина и цитохрома с6 с цитохромом f методами молекулярного моделированияНИР

The study of evolutionary changes in the mechanisms of protein-protein interactions during the plastocyanin and cytochrome c6 with cytochrome f complex formation using molecular modeling methods

Источник финансирования НИР

грант Президента РФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 6 мая 2022 г.-31 декабря 2022 г. Изучение эволюционных изменений в механизмах белок белковых взаимодействий при формировании комплекса пластоцианина и цитохрома с6 с цитохромом f методами молекулярного моделирования
Результаты этапа: Получены структуры предварительных диффузионно-столкновительных комплексов электрон-транспортных белков пластоцианина и цитохрома f, цитохрома c6 и цитохрома f, из цианобактерий и зеленых водорослей. В каждом случае проведен анализ контактов.
2 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. Изучение эволюционных изменений в механизмах белок белковых взаимодействий при формировании комплекса пластоцианина и цитохрома с6 с цитохромом f методами молекулярного моделирования
Результаты этапа: На втором этапе выполнения проекта были рассчитаны траектории молекулярной динамики трансформации полученных на первом этапе диффузионно-столкновительных комплексов в финальные. Для этого центральные структуры кластеров, выявленных на первом этапе, были использованы в качестве начальных конфигураций для полноатомных молекулярно-динамических расчетов в явно заданном растворителе. Такой уровень детализации позволил наравне с электростатическими взаимодействиями выявить и учесть контакты гидрофобных аминокислот и установить механизмы формирования финального комплекса в разных фотосинтезирующих организмах. В результате расчетов молекулярной динамики было получено множество конформаций комплекса белков пластоцианина и цитохрома f в различных состояниях, когда белки находятся в тесном контакте друг с другом. Для описания взаимной ориентации белков и выявления физико-химических механизмов, лежащих в основе процесса образования белок-белкового комплекса, мы вычислили матрицы контактов аминокислотных остатков двух белков, образующих комплекс. Когда белки находятся в контакте друг с другом, отдельные аминокислотные остатки взаимодействующих белков сближаются. Чтобы определить, какие именно остатки взаимодействуют друг с другом, удобно рассчитать матрицу расстояний (прямоугольную матрицу, в которой номеру столбца соответствует номер аминокислотного остатка в последовательности одного белка, а номеру строки соответствует номер аминокислотного остатка в последовательности другого белка). Значением элемента этой матрицы является расстояние между двумя соответствующими аминокислотами. Из матрицы расстояний легко получить матрицу контактов. В данной работе считается, что в контакте находятся аминокислотные остатки, у которых есть атомы, находящиеся ближе 0,5 нм друг от друга. Матрица контактов представляет собой прямоугольную матрицу, равную по размерности матрице расстояний, в каждой ячейке которой находится число 0 или 1 в зависимости от того, удовлетворяет (1) или нет (0) расстояние между данной парой аминокислотных остатков заданному условию. Если аминокислотные остатки, находящиеся в контакте, имеют противоположные заряды, то такой контакт считается электростатическим. Если оба контактирующих аминокислотных остатка являются гидрофобными (т. е. остатками глицина, аланина, валина, лейцина, изолейцина, фенилаланина, метионина, цистеина, тирозина и триптофана), то и сам контакт рассматривается как гидрофобный. Оценить изменение общего числа контактов в белок-белковом интерфейсе в процессе перехода столкновительного комплекса в финальный, а также количество электростатических и гидрофобных контактов по отдельности, удобно по графикам изменения количества этих контактов от времени. Для этого с использованием матрицы контактов на каждом кадре молекулярно-динамической траектории рассчитывается количество электростатических, гидрофобных и всех контактов. Суммарно были рассчитаны 39 молекулярно-динамических траекторий суммарной продолжительностью около 54 мкс модельного времени. Описание результатов. 1. Взаимодействие пластоцианина и цитохрома 1.1 Взаимодействие пластоцианина и цитохрома f Chlamydomonas reinhardtii Трансформация центральных структур трех ансамблей энергетически выгодных взаимных ориентаций, полученных на предыдущем году выполнения гранта, была исследована методом молекулярной динамики. Молекулярно-динамические расчеты, в которых белки в начальный момент времени имеют взаимную ориентацию как в центральной структуре первого кластера, завершается образованием стабильного комплекса с расстоянием между кофакторами около 1,5 нм, что происходит в первые 1000 нс модельного времени. Молекулярно-динамические расчеты с центральными структурами второго и третьего кластеров чаще всего приводят к образованию стабильных комплексов со сравнительно большими расстояниями (около 3,5 нм) между кофакторами белков. Однако, в одном из расчетов, где в качестве начальных условий использовалась центральная структура третьего кластера произошло формирование стабильного комплекса с расстоянием между кофакторами около 1,6 нм. Исходя из расчетов молекулярной динамики сделан вывод о том, что структуры второго и третьего кластеров не могут легко достигнуть ориентации с расстоянием менее 2,5 нм между кофакторами. Были проанализированы электростатические и гидрофобные контакты, образующиеся в процессе формирования финального комплекса при использовании в качестве начальных условий взаимное расположение белков центральной структуры первого кластера диффузионно-столкновительных комплексов с энергией электростатического притяжения более 8 kT. Можно заметить, что уменьшением расстояния между кофакторами сопровождается образованием гидрофобных контактов, при этом число электростатических контактов значительно не изменяется. В траекториях 1 и 4 присутствует группа электростатических контактов между положительно заряженным аминокислотным остатком лизина (K189) малого домена цитохрома f и отрицательно заряженной областью пластоцианина, сформированной аминокислотными остатками D59, D60 и E84. Данная группа контактов не проявляется в траекториях 2 и 3, где в свою очередь достигаются наименьшие расстояния между кофакторами белков. 1.2 Взаимодействие пластоцианина и цитохрома f Nostoc sp. Трансформация центральных структур двух основных кластеров была исследована методом молекулярной динамики. Оба начальных взаимных расположений в процессе молекулярно-динамических расчетов могут приходить к образованию устойчивых комплексов с расстоянием между кофакторами менее 1,4 нм (второй кластер) и около 2 нм (первый кластер. Финальный комплекс из первого кластера больше похож на экспериментальную структуру, полученную в 2004 году Diaz-Moreno с соавторами (PDB ID: 1TU2). Финальный комплекс из второго кластера более стабилен, чем из первого кластера, но его ориентация сохраняет перевернутое положение пластоцианина в сравнении с положением молекулы в структуре, полученной экспериментально. Были проанализированы электростатические и гидрофобные контакты, образующиеся в процессе формирования финального комплекса при использовании в качестве начальных условий взаимное расположение белков центральной структуры второго кластера диффузионно-столкновительных комплексов с энергией электростатического притяжения более 4 kT. Можно заметить, что гидрофобные контакты приводят к стабилизации комплекса, а контактирующие гидрофобные пары аминокислотных остатков существенно различаются между всеми тремя траекториями. Число электростатических контактов и контактирующие заряженные пары аминокислотных остатков на протяжении моделирования существенно не изменяются. В траектории № 1, где достигается наименьшее расстояние между кофакторами белков, реализуется электростатический контакт положительно заряженного аминокислотного остатка лизина (K35) пластоцианина с отрицательно заряженной областью малого домена цитохрома f (D190 и E189), который не реализуется в двух оставшихся траекториях. 2. Взаимодействие цитохрома c6 и цитохрома f 2.1. Зеленая водоросль C. reinhardtii Для исследования дальнейшей эволюции центральных структур двух ансамблей диффузионно-столкновительных комплексов мы использовали полноатомную молекулярную динамику с явно заданным растворителем. Центральные структуры первого и второго кластеров диффузионно-столкновительных комплексов с энергией электростатического притяжения, превышающей 8 kT, были использованы в качестве исходных структур для молекулярной динамики. Для обоих кластеров были получены три отдельные траектории молекулярной динамики длиной более 1 мкс каждая. Все три траектории, стартовавшие от центральной структуры первого кластера, привели к образованию стабильных комплексов. На всех трех траекториях расстояние между железными центрами белков уменьшается с начальных 3,3 нм до примерно 1,8 нм. Это занимает от 100 нс до 1 мкс, а полученные конечные структуры незначительно отличаются друг от друга, и имеют примерно одинаковое расстояние между железными центрами белков. Общим в образовании этих трех структур является вращение молекулы цитохрома c6 вокруг оси, проходящей через область электростатического контакта двух молекул, образованных петлей, содержащей положительно заряженные остатки лизина K188 и K189 цитохрома f и отрицательно заряженные остатки глутаминовых аминокислот E69, E70 и E71 цитохрома c6. Результатом этого вращения является сближение кофакторов белков. Что касается второго кластера 8 kT, то во всех трех МД-траекториях, начинающихся от его центральной структуры, расстояние между кофакторами не опускалось ниже 3 нм и стабильный комплекс не образовывался. Были проанализированы электростатические и гидрофобные контакты, образующиеся в процессе формирования финального комплекса при использовании в качестве начальных условий взаимное расположение белков центральной структуры первого кластера диффузионно-столкновительных комплексов с энергией электростатического притяжения более 8 kT. Чтобы выявить вклад отдельных заряженных аминокислотных остатков в связывание двух белков, мы рассчитали матрицы контактов во всех молекулярно-динамических траекториях центральной структуры первого кластера 8 kT. Мы выяснили, что контакт K189 – E69 присутствует во всех структурах диффузионно-столкновительных комплексов, обнаруженных во всех кластерах 8 kT. Соседний контакт K188 – E69 также часто встречается в предварительных и финальных комплексах, однако его встречаемость в структурах второго кластера намного меньше, всего 24%. Но контакт K188 – E69 более представлен во всех трех стабильных комплексах, образующихся в расчетах молекулярной динамики. Гидрофобные контакты, как и в случае взаимодействия пластоцианина и цитохрома f зеленой водоросли стабилизируют финальный комплекс, а увеличение их числа сопровождается уменьшением расстояния между кофакторов. 2.2 Nostoc Дальнейшая эволюция центральных структур диффузионно-столкновительных комплексов выявленных ранее кластеров была исследована методом молекулярной динамики. Как и в случае с зелеными водорослями, центральные структуры использовались в качестве начальных для моделирования динамики их превращения в финальные комплексы с учетом конформационной подвижности молекул. Мы получили четыре независимых молекулярно-динамические траектории продолжительностью более 1.5 мкс каждая. Первые три расчета закончились формированием стабильного комплекса с расстояниями между кофакторами около 1.8 нм, 1.9 нм и 2 нм примерно за 100 нс. У четвертой траектории расстояние между кофакторами с самого начала начало расти и не опускалось ниже 4 нм, то есть в данной траектории стабильный финальный комплекс не образовался. Были проанализированы электростатические и гидрофобные контакты, образующиеся в процессе формирования финального комплекса при использовании в качестве начальных условий взаимное расположение белков центральной структуры первого кластера диффузионно-столкновительных комплексов с энергией электростатического притяжения более 6 kT. Стоит отметить, что подавляющая часть электростатических контактов, которая обуславливала взаимную ориентацию молекул в процессе формирования дуффузионно-столкновительного комплекса, разрушается при формировании финального комплекса. При этом наименьшее расстояние между кофакторами достигается в траекториях, где реализуется пара контактов между отрицательно заряженной областью цитохрома f (D100, E87) и положительно заряженными аминокислотными остатками лизина цитохрома c6 (K8, K66). Гидрофобные контакты, как и в случае взаимодействия цитохрома c6 и цитохрома f зеленой водоросли стабилизируют финальный комплекс, а увеличение их числа сопровождается уменьшением расстояния между кофакторов. Данные, полученные в результате выполнения настоящего проекта, позволяют судить о том, что, несмотря на структурное сходство исследованных электрон-транспортных белков у разных фотосинтезирующих организмов, сложность молекулярных механизмов комплексообразования возрастает в следующей последовательности: негетероцистные цианобактерии – гетероцистные цианобактерии – зеленые водоросли. Полученные в рамках данного исследования результаты существенно расширили наше понимание механизмов белок-белковых взаимодействий и их изменений в процессе эволюции, сопряженных с увеличением их эффективности. В настоящее время стали доступны экспериментальные данные о пространственных структурах многих белков, в том числе тех, которые вовлечены в перенос электрона в процессах фотосинтеза и дыхания. Удалось соотнести структурные изменения в белках и то, каким образом эти особенности строения электрон-транспортных белков определяют их способность к формированию стабильного комплекса, пригодного для передачи электрона. Результаты научного исследования также помогут в интерпретации данных парамагнитного ЯМР.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".