ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИСТИНА ПсковГУ |
||
ИК-Фурье спектроскопия НПВО – стандартный метод исследования поверхностных слоев образца, при котором образец помещается в непосредственный контакт с кристаллом НПВО. Поскольку поверхность кристалла исключить из таких измерений невозможно, то возникает важная проблема определения причины изменения ИК-Фурье спектров при взаимодействии различных веществ с поверхностью. В рамках этой проблемы может быть поставлен целый ряд оригинальных задач, в частности, выявление спектральных изменений, происходящих при помещении различных смесей на поверхность кристалла, а также установление изменений спектральных линий при осаждении белков на кристалл и наличии промежуточных слоев. При этом важно определить природу взаимодействия молекул с поверхностью кристалла НПВО. Ранее в ходе измерения скоростных характеристик химических реакций с помощью метода ИК-Фурье спектроскопии НПВО обнаружено, что спектры некоторых чистых веществ и смесей при помещении непосредственно на кристалл НПВО (алмаз) меняются с течением времени. Определение характерных изменений в ИК спектрах различных химических систем позволит корректно интерпретировать спектры, измеренные в конфигурации НПВО.
ATR FTIR is a commonly applied method of surface layers studies when the sample has an optical contact with ATR crystal. The crystal surface may significantly impact FTIR spectra of various samples. In the frames of this problem, the series of original studies can be suggested. In particular, analysis of the spectral changes observed upon interaction of various liquid mixtures and solutions with the ATR crystal. It seems to be very important to understand the fundamental aspects of such an interaction. Earlier, we have demonstrated that in ATR FTIR geometry the spectra of some pure substances are time-dependant. Additional experiments are needed to correctly interpret the spectral changes.
Ожидаемыми научными результатами проекта в целом являются: 1. Выявление спектральных изменений, которые происходят в ИК спектрах при помещении различных смесей с реагирующими и не реагирующими компонентами на поверхность кристалла НПВО (алмаза). (Такого рода изменения известны для различных поверхностей, но неизвестны для поверхности алмаза как элемента НПВО.) 2. Определение спектральных линий, которые изменяются или не изменяются при осаждении на кристалл НПВО (алмаз) белков, и, следовательно, могут использоваться при анализе функциональной активности. (Ожидаемый результат является оригинальным.) 3. Установление общих и индивидуальных механизмов взаимодействия молекул растворенных веществ и молекул растворителя для различных смесей с поверхностью алмаза. (Ожидаемый результат является оригинальным.) 4. Выявление спектральных изменений, происходящих в системе типа алмаз - промежуточное вещество - исследуемое вещество. (Ожидаемый результат является оригинальным.)
(1) Измерения скоростных характеристик химических реакций с помощью ИК-Фурье спектроскопии показало, что спектры некоторых чистых веществ и смесей при помещении на кристалл НПВО меняются с течением времени. (2) В случае помещения реакционной смеси с ферментом на кристалл НПВО одновременно с процессом спонтанного гидролиза протекает процесс, который не позволяет получать воспроизводимые результаты. (3) Предложена процедура обработки массива спектральных данных, получаемых в ходе измерения КР и ИК спектров реакционной смеси, позволяющая получать зависимость интенсивности любой линии от времени. (4) Разработан метод обработки ИК и КР спектров, позволяющий проводить сравнение линий, интенсивность которых существенно меньше интенсивности спектрального фона. Метод основан на оригинальной методике вычитания широкополосных фоновых сигналов. (5) Разработан новый метод математической обработки ИК и КР спектров, позволяющий проводить сравнение не обработанных спектров между собой даже в случае, когда фоновые сигналы в спектрах имеют различную форму и интенсивность. Коллектив располагает следующим оборудованием. 1. ИК спектрометр Nicolet 6700 с приставкой НПВО. 2. Многофункциональный лазерный КР спектрометр с несколькими источниками и многоканальной системой регистрации со спектральным разрешением 2 см-1. Возможны эксперименты по спонтанному и резонансному КР. Система позволяют исследовать растворы, кристаллы и порошками. Для обработки спектров используется пакет оригинальных программ, разработанных авторами НИР. 3. Спектрофотометры "Ocean Optics HR-4000" и "Evolution 220" для измерения спектров поглощения как прозрачных, так и непрозрачных образцов с использованием интегрирующей сферы. 4. Коллектив располагает персональными компьютерами с программным обеспечением MODYP, MOPAC, Gaussian 03 и имеет постоянный доступ к суперкомпьютерным кластерам МГУ.
Показано, что поверхность кристалла нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО) - алмаза - может оказывать существенное влияние на результаты измерения ИК-Фурье спектров ИК поглощения. При измерении спектров растворов значительную роль могут играть процессы испарения. Различная скорость испарения компонент раствора со свободной поверхности капли, нанесённой на кристалл НПВО приводит к изменению относительных концентраций этих компонент, что меняет измеряемые спектры. При устранении возможности испарения спектральные изменения также происходят и связаны с конформационными изменениями молекул образца вблизи поверхности алмаза, а также с возникновением вблизи поверхности слоя, обогащённого или обеднённого растворёнными молекулами. Однако, обнаруженные изменения уже не столь существенны, как при наличии испарения и составляют лишь несколько процентов. Значительные конформационные изменения вблизи поверхности алмаза имеют место при работе с растворами белков. Продемонстрированы глобальные изменения в содержании различных элементов вторичной структуры ферментов (химотрипсина и альбумина) при взаимодействии с поверхностью алмаза.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. | Интерпретация спектральных изменений, которые происходят в ИК спектрах при помещении различных смесей на поверхность кристалла НПВО (алмаза) |
Результаты этапа: Установлено, что для двухкомпонентных растворов в ИК спектрах, измеряемых в геометрии НПВО, могут наблюдаться спектральные изменения, связанные с (i) протеканием в смеси реакции, (ii) изменением концентраций компонент за счёт испарения и/или (iii) взаимодействием компонент с кристаллом НПВО. При взаимодействии с кристаллом изменения различны для линий на разных частотах за счёт разных глубин проникновения излучения в образец. Разные скорости изменения интенсивностей линий на разных частотах позволяют говорить о неоднородном распределении компонентов раствора в направлении, перпендикулярном поверхности кристалла НПВО. Выявлено, что вблизи поверхности кристалла НПВО раствор ДНФА в ацетонитриле за счёт испарения растворителя и существенного увеличения плотности переходит в новую жидкую фазу. Поскольку ацетонитрил и ДНФА не взаимодействуют химически, то обнаруженная новая фаза, по всей видимости, стабилизируется водородными связями. | ||
2 | 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. | Изменения конформационно-значимых линий в КР спектрах белков и кинетики ИК-Фурье спектров жидкостей при взаимодействии с кристаллом НПВО |
Результаты этапа: Методом ИК-Фурье спектроскопии исследованы смеси с реагирующими и не реагирующими химическими компонентами при их помещении на поверхность кристалла НПВО (алмаза) в конфигурации, исключающей процессы испарения. Определены и интерпретированы характерные спектральные изменения. Помещение раствора на кристалл НПВО может приводить к перераспределению компонентов раствора вблизи поверхности кристалла в слое толщиной несколько микрометров и образованию квазикристаллических структур. Методом КР микроспектроскопии измерены спектры лиофилизованного химотрипсина и белка, осаждённого на поверхность кристалла НПВО при высыхании из водного раствора. Вторичная структура белка меняется при переходе от микрокристаллического лиофилизованного состояния к высушенному из раствора при нормальных условиях, а так же имеет особенности для молекул расположенных в высушенном образце на границе раздела с кристаллом НПВО. | ||
3 | 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. | Механизмы взаимодействия молекул растворенных веществ и растворителя с поверхностью алмаза |
Результаты этапа: Изменения, наблюдаемые в ИК спектрах водных растворов белков, измеренных в геометрии НПВО. Прямое сравнение ИК-Фурье спектров растворов химотрипсина в области конформационно чувствительных полос Амид I и Амид II затруднительно. Однако, сравнение вторых производных спектров позволяет определить изменения вторичной структуры молекул. Таким образом, было проведено сравнение первого и последнего спектров в сериях, измеренных сразу после помещения раствора на кристалл НПВО и через час пребывания на нем. В производной спектров в области Амид I присутствует две компоненты, причем интенсивная компонента на 1630 см-1 перекрывается с деформационным колебанием молекул воды. Но поскольку линия валентных колебаний воды в области 3000-3500 см-1 остается неизменной, то наблюдаемые изменения можно объяснить лишь изменениями полосы Амид I химотрипсина. Для раствора химотрипсина CT-1 в концентрации 100 мг/мл наблюдается перераспределение компонент чувствительной ко вторичной структуре полосы Амид II в области 1500-1560 см-1. Для раствора CT-2 в концентрации 200 мг/мл наблюдается уменьшение интенсивности высокочастотной компоненты полосы Амид II на 1545 см-1. Различия в изменениях полосы Амид II можно объяснить отличием вторичной структуры молекул ферментов CT-1 и CT-2. В тех же спектральных областях было проведено сравнение ИК-Фурье спектров растворов альбумина BSA в концентрациях 100 и 200 мг/мл. Для раствора в концентрации 100 мг/мл изменений в спектрах второй производной не наблюдаются. Для раствора в концентрации 200 мг/мл наблюдается перераспределение интенсивности линий на частотах 1633 и 1646 см-1 и небольшое уменьшение интенсивности линии на частоте 1545 см-1. Происходящие со временем изменения интенсивности спектральных компонент и их сдвиг может объясняться особой организацией белковых молекул вблизи поверхности кристалла НПВО, что приводит к изменениям в их вторичной структуре. Это относится к молекулам, расположенным в непосредственной близости к поверхности кристалла НПВО. Изменения, наблюдаемые в ИК спектрах белков, высохших на кристалле НПВО. Сравнение спектров водного раствора химотрипсина CT-1 (100 мг/мл), этого же раствора, высохшего на поверхности НПВО кристалла, и спектра порошка CT-1 показало следующее. Ширина полосы Амид I химотрипсина в растворе и порошке совпадает, в то время как ширина этой же полосы в высохшем на поверхности алмаза образце больше. Также можно утверждать, что наблюдаются отличия для полос Амид II и Амид III. В спектре высохшего на кристалле белка также наблюдаются изменения в диапазоне 1000-1110 см-1. Были обнаружены отличия в конформационно чувствительной линии Амид I для спектров раствора белка, который высыхал в непосредственном контакте с поверхностью алмаза НПВО, и тем, что не соприкасался с поверхностью алмаза. Деконволюция полученных спектров позволяет выделить четыре компоненты полосы Амид I: компоненты колебаний боковой цепи (положение максимума в диапазоне 1610-1616 см-1), двух компонент колебаний β-структурных элементов (1629-1632 и 1687-1690 см-1) и компоненты колебаний α-структурных элементов (1657-1662 см-1). Под колебаниями боковой цепи понимают межмолекулярные С–H колебания боковых элементов аминокислот [J. Wantyghem, M.H. Baron, M. Picquart, F. Lavialle. Conformational changes of Robinia pseudoacacia lectin related to modifications of the environment: FTIR investigation. // Biochemistry, 1990, 29(28), 6600-6609]. α-Химотрипсин является β-структурированным белком. Это проявляется в спектре порошка CT-1 в виде интенсивной компоненты на частоте 1632 см-1 и слабо выраженной компоненты на частоте 1661 см-1, соответствующей α-структурным элементам. При высыхании раствора CT-1 наблюдается смещение частоты и перераспределение интенсивности между компонентами, соответствующими колебаниям боковой цепи и β-листов. Причем по соотношению компонент на частотах 1616 и 1632 см-1 в спектрах высохшего раствора можно сказать, что количество β-структурных элементов в молекулах белка, прилегающих к кристаллу алмаза, меньше, чем в молекулах со свободной поверхности высохшего раствора. Если также учесть изменение соотношения между компонентами 1657 и 1689 см-1, то можно говорить о небольшом увеличении содержания α-структурных элементов в белке на границе раздела раствор-алмаз. Наблюдаемые для полосы Амид I изменения подтверждаются изменениями, наблюдаемые для полосы Амид II. Видны незначительное увеличение интенсивности и смещение линии в диапазоне 1540-1550 см-1, соответствующей α-структурным элементам. Для высохшего раствора по сравнению с порошком наблюдается перераспределение компонент на 1495 и 1510 см-1, которые можно соотнести с элементами β-структуры. Положение этих компонент чувствительно к колебаниям N-H, которые, в свою очередь, чувствительны к образованию водородных связей [Barth A. Infrared spectroscopy of proteins. // Biochimica et Biophysica Acta, 2007, 1767, 1073-1101]. Было проведено также сравнение спектров водного раствора альбумина (100 мг/мл), этого же раствора, высохшего на поверхности НПВО кристалла, и порошка альбумина. При высыхании раствора фермента изменяется форма и ширина полосы Амид I. Происходят также значительные изменения в области полос Амид II и III в спектре высохшего раствора белка по сравнению с лиофилизованным образцом. ИК спектры, измеренные в области полос Амид I и II для лиофилизованного альбумина, а также его высохшего раствора, показали следующее. Обнаружены отличия в конформационно-чувствительной линии Амид I для спектров раствора белка, который высыхал в непосредственном контакте с поверхностью алмаза НПВО. Он отличается от спектра верхней поверхности пленки, которая не соприкасалась с поверхностью алмаза. При высыхании раствора альбумина наблюдается смещение компонент на частотах 1650 и 1684 см-1. При высыхании наблюдается рост компоненты на частоте 1648 см-1, соответствующей α-спиралям, что может говорить об относительном увеличении количества таких элементов. Для свободной поверхности контрольного образца наблюдаются такие же изменения, но в меньшей степени. В области полосы Амид II при высыхании раствора наблюдается перераспределение интенсивности между компонентами на частотах 1495 и 1511 см-1. Причем компонента на 1511 см-1 увеличивается для образца, высохшего в контакте с поверхностью кристалла НПВО алмаза, и уменьшается для свободной поверхности контрольного образца. Компоненту на часоте 1511 см-1 связывают с колебаниями боковых цепей аминокислоты тирозина [K. Murayama, M. Tomida. Heat-Induced Secondary Structure and Conformation Change of Bovine Serum Albumin Investigated by Fourier Transform Infrared Spectroscopy. // Biochemistry, 2004, 43(36), 11526-11532], а существенный вклад в колебание на 1495 см-1 вносит фенилаланин [R.J. Jakobsen, F.M. Wasacz. Infrared Spectra-Structure Correlations and Adsorption Behavior for Helix Proteins. // Applied Spectroscopy, 1990, 44(9), 1478-1490]. При высыхании раствора альбумина наблюдается существенный рост компоненты на 1536 см-1, связанный с увеличением содержания α-структурных элементов [K. Kato, T. Matsui, S. Tanaka. Quantitative Estimation of α-Helix Coil Content in Bovine Serum Albumin by Fourier Transform-Infrared Spectroscopy. // Applied Spectroscopy, 1987, 41(5), 861-865.]. Этот результат соответствует результату, полученному при анализе полосы Амид I. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".
№ | Имя | Описание | Имя файла | Размер | Добавлен |
---|