ИСТИНА

Установление влияния взаимодействия белков клеточной среды и внеклеточного матрикса с матрицами на основе поли-N-изопропилакриламида (PNIPAM) на скорость и закономерности открепления клеточных пластов

The possibilities of thermoresponsive polymers’ use in regenerative medicine and drug delivery systems are determined by the interaction of these polymers with the components of biological systems, primarily proteins, and cells. Controlled adsorption of proteins on the surface of thermoresponsive polymers makes it possible to control the processes of cell attachment/detachment while obtaining cell sheets with a developed extracellular matrix. In the proposed project, electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy in the framework of the spin probe and spin-label techniques, as well as dynamic light scattering methods, atomic force microscopy, quartz microbalance, will be applied to study the effect of proteins (albumin and collagen) on the cloud point temperature in solutions of thermoresponsive polymers: poly-N-isopropylacrylamide (PNIPAM) and its biodegradable graft-copolymers with oligolactide. Protein adsorption isotherms on the surface of thermoresponsive coatings based on these polymers, as well as the swelling and dissolution times of matrices in aqueous media, will be measured. The use of spin-labeled PNIPAM and spin-labeled albumin will provide information on the dynamics of polymer chains and adsorbed albumin by mathematical modeling of the obtained EPR spectra. The results obtained during the project can be extended to other systems in which there are processes of interaction of proteins and thermoresponsive polymers, for example, drug and protein delivery systems.

1. Температурные интервалы перехода клубок-глобула в водных растворах поли-N-изопропилакриламида (PNIPAM) и его графт-сополимеров с олиголактидом (P(NIPAM-co-PLA)) с различным содержанием олиголактида в присутствии бычьего сывороточного альбумина (BSA), измеренные с использованием методов турбидиметрии, дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) и спектроскопии электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) в рамках методики спинового зонда. 2. Характеристики неоднородностей в водных растворах PNIPAM и P(NIPAM-co-PLA) в присутствии BSA (размер агломератов, микрополярность глобул, времена вращательной корреляции спиновых зондов внутри глобул), полученные с использованием метода динамического светорассеяния (DLS) и ЭПР. 3. Получение матриц на основе PNIPAM и P(NIPAM-co-PLA), используемых для роста и получения клеточных пластов и содержащих равномерно распределённые спиновые зонды различного размера, с использованием методов спин-коутинга и электроформования. 4. Характеристические времена набухания (при 4-40 oС) и растворения термочувствительных матриц на основе PNIPAM и P(NIPAM-co-PLA) в присутствии BSA и коллагена I внеклеточного матрикса, полученные с использованием спектроскопии ЭПР в рамках методик спинового зонда и спиновой метки. 5. Значения магнитно-резонансных параметров и времен вращательной корелляции спин-меченого альбумина в водных растворах PNIPAM и P(NIPAM-co-PLA) и адсорбированного на поверхность термочувствительных матриц на основе PNIPAM и P(NIPAM-co-PLA) при 4-40 oС. 6. Изотермы адсорбции альбумина на поверхности термочувствительных матриц, измеренные с использованием спектроскопии ЭПР в рамках методики спиновой метки (на примере спин-меченого альбумина) и кварцевых микровесов (QCM).

Руководитель проекта является специалистом в области применения спектроскопии электронного парамагнитного резонанса в химии природных и синтетических полимеров. С ее участием на примере биополимерных матриксов на основе желатина было показано, что анализ формы спектров ЭПР спиновых зондов в сухом полимере и в присутствии паров воды оценивать степень деградации сшитых биополимеров, а также определять чувствительности этих полимеров к влажности воздуха [1].Также с участием Зубановой Е.М. совместно с асп. Ивановой Т.А. были определены температурные интервалы переходов клубок-глобула в водных растворах PNIPAM и его сополимеров с трет-бутилакриламидом (NTBA) и олиголактидом, определена структура и динамика неоднородностей в водных растворах этих полимеров при 0-90 С с использованием спектроскопии ЭПР [2]. Была показана возможность импрегнации графт-сополимера P(NIPAM-co-PLA) низкомолекулярными соединениями в среде скСO2 на примере нитроксильного радикала [3]. Руководитель проекта имеет большой опыт математического моделирования спектров ЭПР ниткроксильных спиновых зондов и спиновых меток. Ей была усовершенствована методика получения индивидуальных спектров нитроксильных радикалов в полимерных глобулах и моделирования спектров ЭПР нитроксильных радикалов, распределенных между водным раствором и полимерной глобулой термочувствительного полимера, заключающаяся в использовании ионов Cu(II) в качестве “тушителя” частиц в водном растворе.

1) Методом турбидиметрии в режиме ступенчатого нагревания показано, что пропускание раствора бычьего сывороточного альбумина (BSA) не меняется в интервале температур 25-40 °С. Температура помутнения (cloud point, Tcp, нижняя критическая температура растворения (НКТР)) 1% водного раствора поли-N-изопропилакриламида (PNIPAM), соотвествующая фазовому переходу клубок-глобула, составила 32 °С, что согласуется с данными, полученными ранее методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) и турбидиметрии в режиме линейного нагрева (см., например, [1].) Добавление BSA в интервале концентраций 2.5-10% приводит к уменьшению Tcp до 31 °С, а также к уменьшению пропускания в температурном интервале 31-34 °С. Аналогичные результаты были обнаружены для 1% водных растворов P(NIPAM-g-PLA) с содержанием олиголактида 3 и 17%. Добавление 5% BSA приводит к уменьшению температуры помутнения на 1-2 °С; при этом температурный интервал фазового перехода в присутствии белков практически не зависит от доли олиголактида. Добавление 0.75% коллагена I приводит к уменьшению температуры помутнения растворов полимеров PNIPAM и P(NIPAM-g-PLA) на 3 градуса и резкому понижению пропускания при небольшом повышении температуры выше Tcp. 2) Методом динамического светорассеяния показано, что добавление BSA с концентрацией 1-2% не приводит к изменению среднего размера частиц в растворах PNIPAM ниже температуры помутнения. В температурном интервале коллапсирования глобул (31-34 °С) добавление BSA приводит к увеличению среднего размера частиц: он возрастает с 80 до 110 нм. 3) Методом ИК-спектроскопии в режиме нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО) было показано, что в пленках, содержащих PNIPAM и BSA в соотношении 2:1, образуются водородные связи между белком и полимером с участием амидной группы. 4) С использованием спектроскопии электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) было показано, что локализация спиновых зондов в водных растворах PNIPAM в ходе фазового перехода клубок-глобула определяется гидрофобностью зонда и его размером. Гидрофобный зонд малого размера (до 10 нм) 4-гидроксибензоато-ТЕМПО практически полностью (до 95% от общего количества) захватывается образующейся в ходе фазового перехода глобулой, в то время как крупный зонд, содержащий длинный алкильный хвост (метил-5-доксилстеарат), не заходит в полимерную глобулу. 5) На основании анализа формы линий спектров ЭПР радикала ТЕМПО в растворе, содержащем изолированные полимерные молекулы (с массовой долей PNIPAM 1%) показано, что структура (полярность среды, подвижность молекул зонда) формирующихся полимерных неоднородностей, а также динамика их образования аналогичны процессам в концентрированных растворах (5-10%) PNIPAM, приводящих к образованию полимерных гелей. 6) Анализ спектров ЭПР радикалов TEMПО и 4-гидроксибензоато-ТЕМПО в растворах BSA показал наличие неоднородностей в интервале температур 25-40 °С, значительно превышающем температурный интервал образования полимерных глобул в растворах PNIPAM и его сополимеров. Доля зонда в таких агломератах растет линейно вместе с концентрацией BSA и даже при комнатной температуре составляет около 50% в случае ТЕМПО и 70% в случае 4-гидрокибензоато-ТЕМПО. Зонд в неоднородностях, образованными молекулами белка, имеет менее полярное окружение по сравнению с водным раствором, по значению константы сверхтонкого взаимодействия (СТВ) близкое к среде формамида. Зонды TEMПО и 4-гидроксибензоато-ТЕМПО в белковых неоднородностях характеризуются медленным вращением со средним временем вращательной корреляции 2.5 нс, что значительно выше подвижности спин-меченых соединений, адсорбированных на поверхности альбуминов или связанных с альбумином за счет комплексообразования по функциональным группам аминокислот (порядка 10 нс) [2]. В качестве таких белковых неоднородностей могут выступать димеры альбумина, доля которых по данным метода малого углового рассеяния может достигать 20% в 4% растворах белка при 25 °С [3]. Диаметр внутренней полости димера белка, оцененный по рентгеноструктурным данным [4], составляет около 30 нм, что не составляет стерических затруднений для локализации т зондов нанометрового размера в этой области. 7) Методом спинового зонда было показано, что микрополярность и микровязкость окружения зонда ТЕМПО в растворах, содержащих 10% PNIPAM и 10% BSA, значительно отличаются от аналогичных параметров растворов, содержащих только один тип макромолекул. Уже при 25 °С примерно 66% молекул ТЕМПО в растворе PNIPAM/BSA вращаются медленно и находятся в слабополярном окружении, по эффективным значениям констант СТВ близком к окружению ТЕМПО в глобулах PNIPAM (при этом раствор остается прозрачным). Молекулы ТЕМПО предположительно находятся внутри флуктуирующих сеток, образованных с участием полимерных и белковых молекул за счет межмолекулярных водородных связей. Анализ спектров ЭПР зонда TEMPO в растворах коллагена I (0.75%) показал отсутствие неоднородностей в температурном диапазоне 4-37 °С, детектируемых методом спинового зонда. При этом спектроскопия ЭПР ТЕМПО в 10% растворе PNIPAM в присутствии коллагена I (0.75%) обнаруживает наличие неоднородностей уже при температурах 25 °С. 8) Методом спиновой метки было показано, что в интервале температур 32-35 °C в растворах PNIPAM начинается формирование неоднородностей, в которых подвижность спиновой метки и, следовательно, полимерных цепей снижены. При температурах выше 35 °С все полимерные цепи претерпевают коллапс. Добавление альбумина в растворы PNIPAM приводит к увеличению доли полимерных цепей в конформации глобулы при одинаковых температурах в интервале фазового перехода клубок-глобула (32-35 °С). Добавление коллагена приводит к появлению полимерных глобул уже при 30 °С; в присутствии 0.75% коллагена доля, рассчитанная путем моделирования спектров ЭПР спин-меченого PNIPAM, составляет 75%, в том время как в отсутствие белка коллапс полимерных цепей, регистрируемый аналогичным методом, начинается только при 33 °С. Установлено, что подвижность полимерных цепей вне температурного интервала коллапсирования полимерных цепей не зависит от наличия альбумина или коллагена. 9) Методом спектроскопии ЭПР показано, что высвобождение ТЕМПО (как модели низкомолекулярного биологически активного соединения) из глобул термочувствительных полимеров PNIPAM и P(NIPAM-g-PLA), сформированных в результате коллапса полимерных цепей, протекает по механизму Фиковской диффузии. 10) Показано, что подвижность нитроксильного фрагмента как метки в спин-меченом BSA в температурном интервале 4-40 °С не зависит от присутствия в растворе PNIPAM, коллапсирующего в этом температурном интервале. Возможно, на локальную подвижность фрагментов цепей BSA, находящихся рядом со спин-меченым звеном цистеина не влияет подвижность других фрагментов макромолекулы белка. 11) Методом спектроскопии ЭПР в рамках методики спиновой метки было установлено, что полное растворение пленок спин-меченого PNIPAM толщиной 40 мкм, полученных методом отливки, в присутствии белков BSA и коллагена I протекает при температурах на 3-5 градусов ниже, чем в их отсутствие. При комнатной температуре вне зависимости от наличия белков в растворе происходит полное растворение пленки, и все полимерные цепи имеют конформацию клубка с подвижностью, отвечающей полимерным цепям в водном растворе. 12) Относительное изменение толщины пленок PNIPAM и P(NIPAM-g-PLA), измеренное методом атомно-силовой микроскопии при набухании в водной среде при 37 °С составляет 20-60% в водной среде и в растворе BSA. В случае PNIPAM в присутствии BSA увеличение толщины пленки при 37 °С максимально и составляет 60%, что может быть связано с адсорбцией белка на поверхности. В случае раствора коллагена толщины пленок практически не меняются при набухании в условиях выше НКТР. По данным АСМ температуры растворения пленок полимеров PNIPAM толщиной ~200 нм и P(NIPAM-g-PLA) толщиной ~100 нм, полученных методом спин-коутинга, не зависят от присутствия BSA, в то время как в растворе коллагена растворение происходит на 5-7 °С ниже, чем в воде. 13) Обнаруженные в ходе выполнения проекта особенности микроструктуры растворов термочувствительных полимеров PNIPAM в присутствии BSA как модели глобулярных белков и коллагена I как модели фибриллярных белков необходимо учитывать при разработке и исследовании систем доставки лекарств на основе PNIPAM. Так как наличие белков в растворе способствует коллапсированию полимерных цепей, высвобождение лекарственного средства из полимерных матриц при температурах вблизи НКТР, близких к физиологическим, может замедляться благодаря конкуренции молекул полимеров и белков за воду. 14) Наличие коллагена в растворах или нанесенного на поверхность пленок PNIPAM и P(NIPAM-g-PLA), приводит понижению температур растворения на 3-5 градусов по сравнению с дистиллированной водой и к значительному изменению механических свойств пленок. Это может приводить к затруднению открепления клеток от покрытий для получения клеточных пластов на основе этих полимеров. Напротив, наличие в растворе глобулярных белков на примере BSA не оказывает существенного влияния на НКТР, процесс растворения полимерных пленок и их механические свойства, их наличие может не оказывать влияния на процесс открепления клеточного пласта, которое обычно проводят при температурах 4-10 °С.