Полимерные рецептуры для формирования защитных биоцидных покрытийНИР

Polymer formulations for protective biocidal coatings

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 13 мая 2022 г.-31 декабря 2022 г. Разработка полимерных рецептур и покрытий на основе интерполиэлектролитных комплексов и стандартных протоколов микробиологических исследований их антимикробной активности
Результаты этапа: Целью работы было получение тонких пленок из полимеров и интерполиэлектролитных комплексов (ИПЭК) на различных поверхностях и исследование их антимикробной активности. Использовали катионный полидиаллилдиметиламмоний хлорид (ПДАДМАХ) и анионный полиакрилат натрия (ПaNa). Смешивание водных растворов ПДАДМАХ и ПаNa приводило к формированию ИПЭК, стабилизированных множественными ионными связями между ионными группами обоих полимеров. Положительно заряженные частицы ИПЭК были получены при соотношении мольных концентраций анионных и катионных групп [-]/[+] = 0,2 (ИПЭК-0,2) и 0,4 (ИПЭК-0,4). ИПЭК дисперсии демонстрировали агрегативную стабильность по крайне мере в течение двух недель после приготовления. Для формирования покрытий растворы ПДАДМАХ, ИПЭК-0,2 и ИПЭК-0,4 наносили на поверхность стекла, фольги, ткани и пластика и сушили до постоянного веса. Для лучшей визуализации покрытий в растворы добавляли краститель, родамин 6G. На поверхности стекла и фольги были получены равномерно окрашенные бледно-розовые пленочные покрытия. Ткань приобретала равномерный бледно-розовый цвет без видимого формирования пленки на поверхности. На гидрофобном пластике капли не растекались. Измерение краевого угла смачивания водных полимерных рецептур на полистирольной поверхности показало уменьшение его значения в ряду ПДАДМАХ – ИПЭК-0,2 – ИПЭК-0,4, что отражало повышение доли неполярных сегментов в составе макромолекул. Добавление поверхностно-активного вещества Silwet в водные полимерные рецептуры улучшило смачиваемость гидрофобной поверхности. Полное растекание композиций ПДАДМАХ, ИПЭК-0,2 и ИПЭК-0,4 на пластиковой поверхности происходило при концентрации 0,01, 0,006 и 0,003 вес.% Silwet, соответственно. Для оптимальной обработки гидрофильных поверхностей рекомендуемая доза полимерных рецептур составляет 5×10-2 мл/см2, для пропитки хлопчатобумажных тканей 1,7×10-2 мл/см2. Для обработки гидрофобных поверхностей она составляет 5×10-2 мл/см2 при условии использования Silwet. Стабильность покрытий на стекле к промыванию водой оценивали через последовательное нанесение на поверхность би-дистиллированной воды и последующую сушку образца. После 4-5 промываний на стеклах оставалось не более 2% от веса нанесенного полимера. Морфологию покрытий изучали методом сканирующей электронной микроскопией. На поверхности покрытий из ПДАДМАХ присутствовали кристаллы NaCl из буферного раствора. На покрытиях из ИПЭК количество кристаллов было значительно больше; дополнительная соль поступала с малыми противоионами, выделяющимися в раствор при образовании ИПЭК. Двукратное промывание покрытий водой приводило к полному удалению соли. При обработке ткани суспензией ИПЭК-0,4 исходная ячеистая структура полотна сохранилась. ИПЭК адсорбировался на поверхности волокон и формировал тонкое покрытие, которое сглаживало рельеф исходной поверхности. Методом атомно-силовой микроскопии показано, что толщина предельно отмытого покрытия из ПДАДМАХ составляет 17-20 нм; из ИПЭК-0,4 - 8 нм. Покрытие из ИПЭК-0,4 в отличие от покрытия ПДАДМАХ имело пористую структуру со средней глубиной пор вплоть до 8 нм. Антимикробная активность покрытий на поверхности стекла протестирована с помощью стандартной методики, включающей нанесение клеточной аликвоты на покрытие, инкубацию клеток в течение 15 или 30 минут, смывание клеток водой на субстрат (питательную среду) и подсчет выросших колоний. В качестве микроорганизмов использовали грамотрицательные бактерии Pseudomonas aeruginosa и грамположительные бактерии Staphylococcus aureus. Антимикробный эффект покрытий после 15-минутной инкубации снижался при увеличении количества клеток в нанесенной аликвоте. Наиболее чувствительными оказались клетки S. аureus: для 200-клеточной аликвоты доля выживших клеток на катионных покрытиях не превышала 5%. Наиболее активным показало себя покрытие из ИПЭК-0,4; при всех аликвотах доля выживших клеток S. аureus была меньше 2%. Клетки P. aeruginosa показали бóльшую выживаемость. Увеличение времени инкубации с 15 до 30 минут снижало количество выживших клеток в 1,5-10 раз. Изучено взаимодействие ПДАДМАХ и ИПЭК с липосомами, сформированными из нейтрального диолеоилфосфохолина и анионного диолеоилфосфосерина, 8/2. Добавление катионных полимерных рецептур приводило сначала к последовательному уменьшению отрицательного поверхностного заряда липосом вплоть до полной его нейтрализации. Затем поверхность липосом приобретала положительный заряд. Мольная концентрация катионных звеньев ПДАДМАХ, при которой происходила нейтрализация заряда, в ряду ПДАДМАХ, ИПЭК-0,2 и ИПЭК-0,4 составляла 2,8×10-4, 3,3×10-4 и 3,9×10-4 М, соответственно. Помимо линейного анионного ПaNa, для получения водных ИПЭК рецептур и покрытий был использован анионный латекс. Добавление раствора ПДАДМАХ к суспензии латексных частиц приводило к электростатической адсорбции поликатиона на латексных микросферах. Состав комплексов описывали соотношением z = [+]/[-], где первый компонент означал мольную концентрацию катионных звеньев ПДАДМАХ, а второй мольную концентрацию поверхностных анионных групп латексных частиц. При z < 0,5 и z > 1,2 растворы оставались гомогенными благодаря стабилизирующему отрицательному или положительному заряду латексных частиц с адсорбированным полимером. Электронейтральный комплекс образовывался при соотношении z = 0,82; максимальная адсорбция поликатиона достигалась при z = 1,5, при этом в растворе регистрировались положительно заряженные частицы ИПЭК с электрофоретической подвижностью +2 (мкм/с)/(В/см). При z > 1,5 в растворе присутствовали положительно заряженные частицы поликомплекса и свободный поликатион. Добавление 3,6 вес.% ПДАДМАХ к латексу (z = 1,5) приводило к формированию положительно заряженного ИПЭК и при этом практически не сказывалось на механических свойствах полученных пленок. При бóльшем весовом содержании ПДАДМАХ пленка становилась двухкомпонентной: она состояла из катионного ИПЭК и свободного ПДАДМАХ. Увеличение содержания ПДАДМАХ в пленке до 50 вес.% приводило к 20-кратному увеличению модуля эластичности, 2-кратному увеличению прочности и 2-кратному снижению предельной деформации разрушения пленок. Пленочные покрытия из исходного латекса и электронейтрального комплекса ПДАДМАХ/латекс показали высокую устойчивость при обработке водой. Двухкомпонентные покрытия с 7,7 вес.% ПДАДМАХ теряли ~67% поликатиона в ходе 7-кратного повторения процедуры промывки. Полимерные рецептуры на основе положительно заряженных ИПЭК ПДАДМАХ/латекс обладают антимикробными свойствами, которые усиливаются при увеличении содержания свободного поликатиона в покрытии. Покрытия с 7,7 вес.% ПДАДМАХ вызывали 100%-ную гибель грамположительных бактерий в течение 5 минут после нанесения. Все грамотрицательные бактерии Escherichia coli погибали в течение 15 минут, более 90% грамотрицательных бактерий P. aeruginosa погибало через 30 минут после нанесения на пленку. Вымывание избытка поликатиона не влияло на бактерицидную активность покрытий в отношении грамположительных бактерий, но значительно снижало бактерицидную активность в отношении грамотрицательных бактерий. Увеличение на порядок количества нанесенных клеток P. aeruginosa приводило к 10-кратному повышению доли выживших клеток. Для получения полимерных покрытий были также использованы полимеры природного происхождения: катионная целлюлоза и анионный альгинат натрия. Эти полимеры образуют положительно заряженные водорастворимые ИПЭК при мольном соотношении звеньев анионного и катионного полимеров [-]/[+] < 0,8 и отрицательно заряженные водорастворимые ИПЭК при [-]/[+] > 2. Поликомплексы не диссоциируют на исходные компоненты вплоть до 0,2 M NaCl. Образование ИПЭК сопровождается взаимной нейтрализацией зарядов полиэлектролитов, что приводит к уменьшению размеров макромолекулярных клубков и прогрессивному снижению вязкости растворов.
2 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. Получение биоцидных полимерных рецептур и покрытий на основе интерполиэлектролитных комплексов со встроенным низкомолекулярным биоцидом
Результаты этапа: Для получения покрытий были использованы нестехиометричные интерполиэлектролитные комплексы (НИПЭК), образованные разноименно заряженными линейными синтетическими полиэлектролитами: анионным гидролизованным полиакрилонитрилом (ГИПАН) – сополимером акриловой кислоты и акриламида и катионным поли-N,N-диаллил-N,N-диметиламмоний хлоридом (ПДАДМАХ). Состав смеси выражали в виде мольного соотношения Z = [+]/[-], где [+] означает концентрацию четвертичных аминогрупп поликатиона, [-] концентрацию карбоксильных групп полианиона. В растворах НИПЭК с Z = 0,2 и 0,4 («анионных» НИПЭК) регистрировали частицы с электрофоретической подвижностью (ЭФП) равной -3,2 и -2,8 (мкм/с)/(В/см), соответственно, и средним гидродинамическим диаметром 195 и 205 нм. Частицы НИПЭК с Z = 2,5 и 5,0 («катионных» НИПЭК) характеризовались значениями ЭФП = 3,6 и 2,4 (мкм/с)/(В/см), соответственно, и средним гидродинамическим диаметром 198 и 300 нм. Для получения покрытий использовали также НИПЭК, образованные противоположно заряженными полисахаридами: анионным альгинатом натрия и катионным кватернизованным этоксилатом гидроксиэтилцеллюлозы. Для связывания низкомолекулярного биоцида, 4-гексилрезорцина (ГР), с частицами НИПЭК его предварительно растворяли в органическом растворителе (ацетоне или этиловом спирте) и смешивали с водными растворами/суспензиями поликомплексов. В результате получали слабо опалесцирующие гомогенные суспензии тройных комплексов НИПЭК-ГР. Гомогенные суспензии тройных комплексов сохраняли стабильность в течение 3-6 месяцев при 5 °С. Полимерные покрытия готовили двумя методами. 1) На стеклянную пластинку или пластиковую пленку Parafilm наносили водные суспензии НИПЭК ГИПАН-ПДАДМАХ с ГР и без него и сушили их до постоянного веса. 2) Пластинку или пленку погружали на 2 минуты в водную суспензию НИПЭК ГИПАН-ПДАДМАХ с ГР и без него. Пластинки/пленки извлекали из раствора и сушили образцы как указано выше. На поверхности стекла были получены однородные пленочные покрытия. При высушивания НИПЭК рецептуры без ГР на поверхности пластика образовывалась неоднородная пленка. Введение ГР в полимерную суспензию обеспечивало сродство полимерной рецептуры к гидрофобной поверхности и ее хорошей адгезии на пластике. Для изучения стабильности покрытий в водном окружении полимерную рецептуру равномерно распределяли на поверхности стекла. Стекла с нанесенными рецептурами сушили до постоянного веса, после чего промывали покрытия дистиллированной водой. После 4-5 промываний на стеклах оставалось не более 2% от веса нанесенной рецептуры ГИПАН-ГР. Использование НИПЭК привело к повышению водостойкости композиций: после 6 промываний на стекле оставалось до 15% от первоначально нанесенной НИПЭК-ГР рецептуры. Нанесение водных растворов катионного НИПЭК альгинат-целлюлоза на чашки Петри из стекла или полистирола приводило к формированию прозрачных гомогенных пленок, которые легко растворялись в воде. Тройной комплекс НИПЭК-ГР формировал на поверхности стекла и полистирола покрытие с равномерным распределением включений белого цвета размером 1-5 мм. После добавления воды покрытие лишь незначительно набухало и оставалось на поверхности. Каждое 2 минутное промывание дистиллированной водой покрытий из тройного комплекса НИПЭК ГИПАН-ПДАДМАХ-ГР на пленке приводило к потере в среднем 2,7 вес.% ГР. Морфологию полимерных покрытий изучали методом сканирующей электронной микроскопии. При 0,1 вес.% содержании ГР покрытия из НИПЭК ГИПАН-ПДАДМАХ-ГР на стекле характеризовались однородной поверхностью. Увеличение содержания ГР до 0,5 вес.% приводило к появлению в полимерной матрице включений округлой формы размером от 40 до 1400 нм. На кривой растяжения исходной пленки Parafilm можно выделить три участка: прямолинейный участок до деформации 1%, появление пика в области деформации 3% и последующее снижение напряжения с выходом на плато и разрывом образца при деформации около 400%. Нанесение покрытия из тройного комплекса НИПЭК ГИПАН-ПДАДМАХ-ГР на поверхность пленки Parafilm не оказывает заметного влияния на ее механические свойства. Взаимодействие НИПЭК с анионными липидными везикулами (липосомами) моделировало взаимодействие поликомплексов с клеточной мембраной. Внутренний объем липосом заполняли раствором 1 М низкомолекулярной соли (NaCl). После добавления к суспензии липосом анионного НИПЭК ГИПАН-ПДАДМАХ и тройного НИПЭК ГИПАН-ПДАДМАХ-ГР в течение часа регистрировали постепенное увеличение проводимости суспензии, что указывало на разрушение липосомальной мембраны. Микробиологические исследования проводили с использованием грамотрицательных бактерий, грамположительных бактерий и дрожжей. Выживаемость микроорганизмов в растворах в присутствии полимерных рецептур оценивали с использованием двух стандартных параметров – минимальной ингибирующей концентрации (МИК) и минимальной бактерицидной концентрации (МБК). Анионные полимерные рецептуры – индивидуальные ГИПАН и альгинат натрия и анионные НИПЭК ГИПАН-ПДАДМАХ оказались нетоксичными для всех исследованных микроорганизмов, в то время как ПДАДМАХ и катионные НИПЭК ГИПАН-ПДАДМАХ проявили антимикробную активность. Катионная целлюлоза не показала токсичности для всех исследованных микроорганизмов. Полимерная рецептура из катионного НИПЭК альгинат-целлюлоза также не проявила антимикробной активности. Тройной катионный НИПЭК альгинат-целлюлоза-ГР подавлял рост всех микроорганизмов. В большинстве случаев значения МИК и МБК тройного комплекса были сравнимы с соответствующим значениями для индивидуального ГР. Антибактериальная активность тройных комплексов катионный НИПЭК ГИПАН-ПДАДМАХ-ГР повышалась при увеличении содержания ГР в рецептуре и доли свободных положительно заряженных звеньев ПДАДМАХ в поликомплексе. Количественная оценка цитотоксичности полимерных покрытий методом подсчета выросших колоний показала, что покрытия из тройного комплекса НИПЭК ГИПАН-ПДАДМАХ-ГР вызывают гибель клеток. Инкубация клеточных суспензий на покрытиях, полученных на поверхности стекла, в течение 45 мин вызывала 99% гибель клеток всех тестовых микроорганизмов. Антибактериальная активность тройных комплексов на основе катионных НИПЭК была выше по сравнению с анионными и возрастала при увеличении количества свободных положительно заряженных звеньев ПДАДМАХ в НИПЭК. Значительная часть микроорганизмов удалялась с катионного полимерного покрытия в течение 3-минутной обработки водой. Увеличение продолжительности обработки водой приводило к снижению числа клеток на поверхности до 20-30% в случае бактерий и 60% для дрожжей. Десорбция клеток всех тестовых микроорганизмов с поверхности покрытия ПДАДМАХ была связана с растворением катионного покрытия при его обработке водой. Это облегчало десорбцию клеток, которые покидали поверхность в виде комплексов с ПДАДМАХ. Жизнеспособность микробных клеток на поверхности оценивали методом их окрашивания с использованием набора флуоресцентных красителей Leave/Dead. Клетки, нанесенные на контрольное стекло без полимерного покрытия, сохраняли способность к делению. Клетки на покрытиях из ПДАДМАХ погибали через 1 ч после нанесения. Эта же методика позволила зафиксировать гибель всех клеток, оставшихся на полимерной покрытии после его промывки водой. Жизнеспособность смытых клеток была проанализирована с помощью традиционной методики – через подсчет количества выросших колоний. Все смытые с ПДАДМАХ покрытия клетки оказались нежизнеспособными. Таким образом, проведенное исследование позволило оценить количество смываемых клеток в ходе стандартной процедуры тестирования выживаемости клеток на биоцидном покрытии и определить жизнеспособность смытых и оставшихся на покрытии клеток.
3 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. Получение биоцидных полимерных рецептур и покрытий на основе интерполиэлектролитных комплексов, включающих биологически активное соединение
Результаты этапа: Для получения интерполиэлектролитных комплексов (ИПЭК) использовали катионный полидиаллилдиметиламмоний хлорид (ПДАДМАХ) и анионный гидролизованный полиакрилонитрил (ГИПАН). Дополнительно были получены водорастворимые ИПЭК из биодеградируемых полисахаридов – анионного альгината натрия и катионной целлюлозы (КЦ). Другая пара анионных ИПЭК была представлена природным ионно-сшитым альгинатным микрогелем и синтетическим катионным ПДАДМАХ. Полученные комплексы содержали избыток анионного полимера («анионные» ИПЭК) или избыток катионного полимера («катионные» ИПЭК). Для усиления антимикробного действия ИПЭК в рецептуры были добавлены низкомолекулярные биологически активные соединения (БАС) – антибиотик доксициклин (DOX), пара-анисовая кислота (ПАК) и белок лизоцим. Для формирования покрытия полимерную рецептуру – раствор полимера, ИПЭК и тройного комплекса ИПЭК-БАС наносили на поверхность и полученные образцы сушили до постоянного веса. Короткое 4-минутное промывание водой покрытия из смеси ГИПАН-ПДАДМАХ-DOX удаляло 75% нанесенных полимеров, а 10-минутная обработка водой удаляла 99,9% покрытия. 4-минутное промывание водой покрытия из ПДАДМАХ оставляло на поверхности стекла слой полимера толщиной около 20 нм, а длительное промывание в течение 24 часов полимерный монослой толщиной 1 нм. Покрытие из смеси альгинат–КЦ–ПАК растворялось в воде, при этом в раствор переходил и низкомолекулярный биоцид. Покрытие из смеси альгинатный микрогель–ПДАДМАХ–лизоцим теряло не более 1% лизоцима после обработки водой в течение 1 часа. Липидная мембрана сферических бислойных везикул (липосом) представляет собой удобную модель цитоплазматической мембраны (ЦПМ) клеток. К суспензии анионных липосом добавляли катионные ИПЭК с участием ПДАДМАХ и двух полианионов – короткого (Mw = 8,5 кДа) и длинного (Mw = 260 кДа) полиакрилата натрия, ПАН1 и ПАН2 соответственно. Добавление к липосомам ИПЭК с коротким ПАН1 инициировало переход ПДАДМАХ из ИПЭК на анионные липосомы; ИПЭК с длинным ПАН2 связывался с липосомами без разрушения. Антимикробные свойства полимерных растворов оценивали по величине их минимальной ингибирующей концентрации (МИК). ПДАДМАХ и ИПЭК с коротким ПАН1 показали сравнимые МИК по отношению к грамотрицательным бактериям Pseudomonas aeruginosa; значение МИК для ИПЭК с длинным ПАН2 было почти в 2 раза выше. Эти результаты коррелируют с механизмом, который описывает перестройку ИПЭК с участием короткого ПАН1, но сохранение целостности ИПЭК с длинным ПАН2 при взаимодействии этих ИПЭК с липосомами. С использованием диско-диффузионного метода и метода инкубации микробной суспензии на поверхности покрытия была проанализирована цитотоксическая активность ряда бинарных ИПЭК и тройных рецептур ИПЭК-БАС. Наиболее выраженный цитотоксический эффект показали покрытия, в состав которых входил доксициклин. Они за 15 минут практически полностью убивали нанесенные на них клетки грамположительных бактерий и дрожжей и существенно снижали численность грамотрицательных бактерий. Физиологическое состояние клеток микроорганизмов в присутствии тестируемых антимикробных композиций оценивали по изменению интегрального показателя метаболизма – скорости выделения углекислого газа, который контролировали в газовой фазе над жидкой средой с культурами бактерий. Катионный ПДАДМАХ более эффективно подавлял дыхание грамположительной S. aureus и грамотрицательной P. aeruginosa, чем анионный полиакрилат натрия (ПАН), что коррелирует с их биоцидной активностью. Антимикробная активность ИПЭК ПДАДМАХ–ПАН определялась присутствием катионного ПДАДМАХ. Добавление ИПЭК инициировало развитие классического стресса у бактерий – подавление дыхания, остановку клеточного деления, окислительный стресс и гибель клеток. Для оценки механизмов биоцидного действия бинарных ИПЭК и тройных комплексов ИПЭК-БАС на клетки бактерий был дополнительно использован неразрушающий витальный метод флуоресцентных зондов с применением сенсора редокс-потенциала клеток (активности оксидоредуктаз) и индикатора целостности цитоплазматической мембраны (ЦПМ). Поведенные исследования показали, что функции ЦПМ ингибируются не только вследствие нарушения её проницаемости, а также и при воздействии полимеров на компоненты мембраны. Предложен механизм действия полимеров/ИПЭК на бактерии, включающий взаимодействие полимеров/ИПЭК с заряженными группами компонентов мембраны и клеточной стенки, ингибирование дыхания, снижение активности оксидоредуктаз и повышение проницаемости ЦПМ. Методом сканирующей электронной микроскопии получены изображения клеток P. aeruginosa на стеклах с полимерным монослоем и полимерным полислоем. Поверхность монослоя покрыта бесформенными конгломератами размером 10-70 мкм, состоящими из клеточной биомассы и биоматрикса. Большинство клеток в контакте с поверхностью находятся в лизированном (разрушенном) состоянии. Перед разрушением бактериальные клетки сильно увеличиваются в размерах – до 5-6 мкм в длину и 3-4 мкм в ширину. Часть клеток в верхних слоях некоторых конгломератов сохраняет форму и, по-видимому, жизнеспособность. Поверхность полислоя также покрыта бесформенными клеточными конгломератами, частично «утопленными» в полимерный слой и/или покрытыми слоем полимера. Количество видимых интактных (предположительно жизнеспособных) клеток в верхних слоях некоторых конгломератов существенно меньше, чем в монослойном варианте. Полученные результаты позволяют рекомендовать полимерные рецептуры для использования в медицине – для обработки наружных поверхностей масок, респираторов и рабочей одежды (бахил, халатов и т.п.) и для нанесения защитных антимкробных покрытий в медицинских, учебных, социальных, пенитенциарных и общественных учреждениях и общественном транспорте. Способ применения разработанных рецептур – пропитка для обработки тканей или использование пульверизаторов или кистей для обработки помещений.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".