Фотофизика и фотохимия светочувствительных биосистем при нелинейном возбужденииНИР

Photophysics and photochemistry of light-sensitive biosystems upon nonlinear excitation

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 13 мая 2022 г.-31 декабря 2022 г. Фотофизика и фотохимия светочувствительных биосистем при нелинейном возбуждении
Результаты этапа: В рамках инвариантного метода многоконфигурационной квазивырожденной теории возмущений второго порядка XMCQDPT2 на основе релаксированной матрицы плотности разработана методика расчета одноэлектронных свойств, необходимых для расчета сечений двухфотонного поглощения. Разработана и апробирована методика расчёта сечений поглощения запутанных пар фотонов на основе данных, получаемых методами квантовой химии. С помощью разработанной методики рассчитаны сечения поглощения запутанных пар фотонов для перехода S0-S2 в белке EGFP и его мутантной форме EGFP T203I. Показано, что увеличение сечения поглощения двух запутанных фотонов в обоих случаях достигает 6 порядков. Из анализа зависимости сечений поглощения запутанных пар фотонов от времени запутывания впервые показано, что характерный период осцилляций усиления поглощения запутанных пар фотонов во флуоресцентном белке EGFP составляет 10 фс. Таким образом, для достижения максимального усиления поглощения в эксперименте с запутанными фотонами необходимо фемтосекундное разрешение. В проекте исследована применимость двухуровневой модели для расчета сечений классического двухфотонного поглощения белка EGFP и его мутантных форм в зависимости от длины волны возбуждения, а также изучена сходимость N-уровневых моделей с увеличением числа промежуточных состояний. Показано, что для ярких однофотонных переходов, сопровождающихся значительным изменением электронной плотности, двухуровневая модель дает наибольший вклад в сечение двухфотонного поглощения. Типичным примером переходов такого типа является S0-S1 переход во флуоресцентных белках. Показано, что переход к N-уровневой модели не дает существенного изменения в сечениях двухфотонного поглощения, что подтверждает применимость двухуровневой модели для этих переходов. Для переходов S0-S2 и S0-S3 минимальная модель, удовлетворительно описывающая экспериментальные данные, включает три состояния, тем самым демонстрируя быструю сходимость N-уровневых моделей для первых трех переходов во флуоресцентных белках. Рассчитанные значения сечений двухфотонного поглощения белка EGFP и EGFP T203I хорошо согласуются с экспериментальными данными как в случае первого перехода, так и более высоколежащих. Проведены исследования по направленным химическим модификациям ближайшего окружения хромофорной группы в белке EGFP с целью увеличения сечения двухфотонного поглощения. Показано, что увеличение сечения двухфотонного поглощения белка EGFP может быть достигнуто путем модификации белкового окружения хромофора при введении точечных мутаций, влияющих на электростатическое поле белка вблизи хромофора. Увеличению сечения отвечает усиление напряженности электрического поля вдоль направления от фенольного кольца хромофора к имидазолоновому, которое может быть достигнуто, например, изменением заряда окружения фенольного кольца хромофора на более положительный, а имидазолонового – на более отрицательный. В совместных теоретических и экспериментальных работах исследован механизм фотоокисления фенолят-аниона в водном растворе в зависимости от длины волны возбуждения. Впервые обнаружено, что при фотоокислении органического хромофора в растворе может образовываться продукт в электронно-возбужденном состоянии. Релаксационная динамика оказывается сильно зависящей от конечного состояния радикала, и в случае электронно-возбужденных состояний рекомбинация происходит на субпикосекундных временах. В проекте разработан и реализован метод расчета фотоэлектронных спектров и спектров действия при колебательной автоэмиссии электронов из слабосвязанных электронно-возбужденных состояний молекулярных анионов в зависимости от длины волны возбуждения. С помощью разработанного метода был исследован механизм колебательной электронной эмиссии из первого электронно-возбужденного состояния аниона хромофора белка GFP при его возбуждении в видимом диапазоне, а также проведена интерпретация низкоэнергетической области его экспериментальных фотоэлектронных спектров. Показано, что распределение электронов по кинетической энергии в фотоэлектронных спектрах этого аниона определяется матричными элементами неадиабатического взаимодействия, связанными с определенными колебательными модами. Разработанный и реализованный метод, а также полученные с его помощью результаты являются важными для интерпретации экспериментальных данных, полученных с помощью спектроскопии действия при многофотонном резонансном возбуждении биологических хромофоров в газовой фазе. В проекте исследованы различные механизмы электронной релаксации анионного хромофора белка GFP в газовой фазе в зависимости от длины волны возбуждения в различных режимах и при разных температурах. На основе проведенных теоретических исследований в проекте предложена экспериментальная схема определения начала полосы поглощения хромофора при резонансном двухфотонном возбуждении хромофора. По результатам работы опубликованы статья в журнале J. Phys. Chem. Lett. 2022, 13(29), 6683–6685 (Q1, IF=6.888). С помощью методов квантовой химии высокого уровня точности исследовано влияние структурных модификаций на квантовый выход флуоресценции (КВФ) производных 2H-пиранона-2, а также предложен анализ процессов их электронной релаксации, объясняющий связь КВФ исследуемых веществ с их структурой. Установленные структурные закономерности, обуславливающие изменения КВФ для рассмотренного класса соединений в результате их химической модификации, могут быть использованы для планирования рационального органического синтеза перспективных флуорофоров, в то время как использованная методология расчётов может быть применена для установления связи химической структуры и КВФ широкого круга других классов органических соединений. В результате проведенного скрининга наноструктур с использованием численного моделирования для фотоконверсии флуоресцентных белков предложено использовать наночастицы серебра, имеющих форму полумесяца с толщиной 20–30 нм, получаемые методом коллоидной литографии с использованием микросфер из полистирола диаметром 200 нм при осаждении серебра под углом к нормали подложки около 30 градусов. Расчет спектров экстинкции показал, что массивы таких наночастиц имеют резонансную плазмонную моду при продольной поляризации света с длиной волны около 900–950 нм, что соответствует длине волны в спектрах двухфотонного поглощения EGFP, а усиление напряженности электрического поля вблизи острых концов наночастицы может превышать один порядок, что делает такие частицы перспективными для проведения фотоконверсии флуоресцентных белков при нелинейном двухфотонном поглощении. Отработана экспериментальная методика получения наночастиц серебра с формой полумесяца и получены массивы таких наноструктур на подложках из кремния и стекла. Размер и форма наночастиц изучена методом растровой электронной микроскопии.
2 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. Фотофизика и фотохимия светочувствительных биосистем при нелинейном возбуждении
Результаты этапа: Выявлены общие закономерности по влиянию различных факторов на величину сечения двухфотонного поглощения хромофорных групп ретиналь-содержащих белков первого и второго типа при переходе S0-S1. Исследовано влияние конформационной подвижности хромофорной группы и ее ближайшего окружения на величину сечения двухфотонного поглощения. Как и в случае флуоресцентных белков, показано, что основной вклад в сечение двухфотонного поглощения родопсинов вносят начальное и конечное состояния, а величина сечения двухфотонного поглощения хорошо описывается в рамках двухуровневой модели с учетом только двух каналов, 0 - 0 - 1 и 0 - 1 - 1, связанных с постоянными дипольными моментами этих состояний. В рамках классического двухфотонного поглощения одним из основных факторов, влияющих на величину сечения, является разность средних дипольных моментов в начальном и конечном состояниях; вследствие этого наблюдается однозначная корреляция между увеличением сечения двухфотонного поглощения и изменением средних дипольных моментов при переходе S0 - S1. Однако в случае родопсинов состояние S2 и соответствующий канал перехода через промежуточное состояние 0 - 2 - 1 вносит больший вклад в величину сечения, что связано с различием в энергетическом спектре катионного хромофора родопсинов и анионного хромофора флуоресцентных белков. В случае молекулярных анионов состояние S1 хорошо отделено по энергии от более высоко лежащих состояний, тогда как в случае катиона состояния S1 и S2 лежат значительно ближе друг к другу, так что вклад канала 0 - 2 - 1 достигает 10% от общей величины сечения, тогда как 90% обусловлены вкладами каналов через постоянные дипольные моменты. Показано, что хорошая применимость двухуровневой модели для описания переходов S0 - S1 во флуоресцентных белках и родопсинах обусловлена характером этих переходов, в обоих случаях сопровождающихся переносом заряда при возбуждении. Необходимо отметить, что в случае протонированного основания Шиффа ретиналя перенос заряда имеет ярко выраженный характер, что приводит к существенно большему сечению классического двухфотонного поглощения родопсинов (300–700 GM) по сравнению с флуоресцентными белками (20–45 GM). Разработан и реализован алгоритм расчета вероятности поглощения запутанных пар фотонов с помощью прямого суммирования по промежуточным состояниям и изучена сходимость N-уровневых моделей с увеличением числа промежуточных состояний при переходе S0 - S1 на примере флуоресцентных белков EGFP и его модификации EGFP T203I. Выявлены основные факторы по влиянию квантового запутывания фотонов на величину сечения двухфотонного поглощения. В отличие от классического двухфотонного поглощения (TPA), скорость которого квадратична по начальной плотности потока фотонов, скорость запутанного двухфотонного поглощения (ETPA) линейна по плотности потока коррелированных пар фотонов, а вероятность поглощения в явном виде зависит от времени корреляции двух фотонов. В случае перехода S0 - S1 каналы через постоянные дипольные моменты доминируют как в случае классического TPA, так и в случае квантового ETPA, а двухуровневую модель можно использовать для корректного описания зависимости вероятности поглощения от времени корреляции двух фотонов, осциллирующей в фемтосекундном масштабе времени, при этом вероятность изменяется от нуля до значений, на порядки превышающих классическую вероятность. В рамках двухуровневой модели нами впервые показано, что сечение ETPA зависит не только от разницы постоянных дипольных моментов в основном и конечном состояниях, как в случае классического TPA, но и от их суммы. Квантовый вклад в ETPA, зависящий от абсолютной величины постоянных дипольных моментов, намного превышает классический вклад, связанный с разницей постоянных дипольных моментов, что и обусловливает многократное усиление ETPA. Необходимо отметить, что модификация локального белкового окружения хромофора в EGFP T203I по-разному влияет на силу классического и запутанного двухфотонного поглощения. Классический вклад выше в случае белка EGFP, тогда как квантовый вклад выше в случае EGFP T203I. Двухуровневая модель TLM, учитывающая только механизм двухфотонного возбуждения через постоянные дипольные моменты, правильно отражает эту тенденцию: определяющей величиной для классического двухфотонного поглощения является разность постоянных дипольных моментов состояний S0 и S1, а для запутанного поглощения –- их сумма. Таким образом, нами впервые показано, что вероятности поглощения некоррелированных и коррелированных пар фотонов могут кардинально отличаться из-за принципиально разных физических параметров, влияющих на сечения TPA и ETPA. Разработан и реализован алгоритм для расчета неравновесной заселенности колебательных уровней фотоактивных биомолекулярных систем в электронно-возбужденном состоянии при нелинейном двухфотонном возбуждении. Показано, что неравновесная заселенность активных колебательных мод при однофотонном и двухфотонном возбуждении разная, что связано с различными механизмами вибронного взаимодействия: при нелинейном двухфотонном возбуждении возрастает активность тех колебательных мод, при смещениях вдоль которых меняется постоянный дипольный момент в основном и/или возбужденном состоянии. Разработан и реализован алгоритм для расчета констант скоростей фотоиндуцированного переноса электрона из электронно-возбужденных состояний фотоактивных белков при линейном и нелинейном двухфотонном возбуждении в зависимости от длины волны возбуждения с учетом неравновесной заселенности колебательных мод. Метод расчета константы скорости фотопереноса электрона основан на теории Биксона-Эфримы-Ульструпа-Йортнера. Подтвержден колебательный механизм фотоиндуцированного переноса электрона с анионного хромофора в белке EGFP на молекулярный кислород. Показано, что фотоиндуцированный перенос электрона промотируется валентным колебанием сопряженной системы хромофора. Проведены совместные экспериментальные и теоретические работы по исследованию механизмов электронной релаксации изолированного анионного хромофора зеленого флуоресцентного белка в зависимости от длины волны облучения. Показано, что при энергиях возбуждения, совпадающих с переходом S0 - S1, можно выделить четыре энергетические области, характеризующиеся различными механизмами релаксации: флуоресценция, внутренняя конверсия через коническое пересечение, колебательная автоэмиссия из электронно-возбужденного состояния, прямой канал фотоионизации. С помощью метода, разработанного в рамках проекта, впервые рассчитаны спектры действия анионного хромофора зеленого флуоресцентного белка при колебательной автоэмиссии электронов из первого электронно-возбужденного состояния и проведена интерпретация экспериментальных колебательно-разрешенных спектров, полученных с помощью спектроскопии действия при резонансно-усиленной многофотонной ионизации биологических хромофоров в газовой фазе при криогенных температурах. Полученные результаты позволяют идентифицировать неадиабатический канал фотоионизации в экспериментальных спектрах и объяснить природу специфичности в механизме образования низкоэнергетических электронов. Разработанный и реализованный метод, а также полученные с его помощью результаты являются чрезвычайно важными для интерпретации экспериментальных данных. С помощью численного моделирования изучен процесс возбуждения и релаксации зеленого флуоресцентного белка. Показано, что благодаря эффективному перекрыванию полосы двухфотонного поглощения зеленого флуоресцентного белка с длинноволновой полосой плазмонного резонанса наночастицы серебра с формой полумесяца при облучении светом с длиной волны 950 нм возможно значительное, до 4 порядков, усиление интенсивности флуоресценции белка, вызванное увеличением скорости двухфотонного возбуждения в областях с высокой напряженностью электрического поля. Проведена оценка изменения времени жизни возбужденного состояния хромофора зеленого флуоресцентного белка вблизи наночастицы серебра с формой полумесяца, которое составило 0.006 нс. Получены значения констант излучательной и безызлучательной релаксации в присутствии наночастицы, которые составили k(fl)=3.9*10^9 c-1 и k(loss)=1.5*10^11 c-1, соответственно. Оптимизирована методика формирования наночастиц металлов с формой полумесяца. Получены образцы массивов наночастиц для проведения экспериментов по изучению эффективности фотоконверсии флуоресцентных белков EGFP и NowGFP. Разработана новая оригинальная методика получения хиральных плазмонных наночастиц с формой нанокрючков. Установлено, что полученные образцы обладают сильным хирооптичиеским откликом в диапазоне 500--700 нм. По результатам проекта в 2023 году опубликованы 3 статьи, 2 из которых в журналах 1 квартиля. Результаты проекта были представлены руководителем и основным исполнителем в виде 4 приглашенных докладов на международных и всероссийских конференциях, в том числе на международной конференции Asia Pacific Conference of Theoretical and Computational Chemistry (APATCC-10), Вьетнам, 19-23 февраля 2023 и первой всероссийской конференции по компьютерному материаловедению, Сколково, Россия, 30 октября - 2 ноября 2023; а также в виде 9 устных и 2 стендовых докладов исполнителями проекта, в том числе его молодыми участниками.
3 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. Фотофизика и фотохимия светочувствительных биосистем при нелинейном возбуждении
Результаты этапа: 1. Проведено моделирование и анализ электронно-колебательных спектров двухфотонного поглощения флуоресцентных и ретиналь-содержащих белков на основе данных квантовохимических расчетов, полученных с использованием инвариантной многоконфигурационной квазивырожденной теории возмущений XMCQDPT2. В результате проведенных систематических исследований показано, что при переходе от однофотонного к классическому двухфотонному поглощению в указанных системах увеличивается относительная интенсивность пика, соответствующего переходу 0-1 наиболее активной колебательной моды, связанной с высокочастотными валентными колебаниями сопряженной системы хромофорной группы. Показано, что доминирующую роль при этом играет диагональный вклад герцберг-теллеровского взаимодействия, что обуславливает необходимость учета вибронных вкладов за рамками приближения Кондона. Впервые показано, что наиболее сильно связаны с двухфотонным переходом те колебательные моды, при которых происходит существенное изменение среднего дипольного момента в плоскости сопряжения хромофорной группы в основном электронном состоянии. 2. Проведено молекулярно-динамическое моделирование конформационной подвижности активного центра зеленого флуоресцентного белка и квантовохимический расчет параметров вдоль молекулярно-динамической траектории для оценки сечений классического двухфотонного поглощения с помощью методов квантовой химии высокого уровня точности. На основе полученных результатов определены величины вкладов однородного и неоднородного уширения в спектры двухфотонного поглощения зеленого флуоресцентного белка. Показано, что вклад неоднородного уширения значительно меньше вклада однородного. При учете неоднородного уширения с помощью гауссовой функции с шириной на полувысоте, равной 533 см^-1, рассчитанный в модели смещенных многомерных гармонических поверхностей с параллельными нормальными модами и приближении Герцберг-Теллера спектр классического двухфотонного поглощения белка EGFP при температуре 300 K хорошо воспроизводит экспериментальную форму спектра. 3. Проведены исследования влияния различных режимов возбуждения на сечения двухфотонного поглощения флуоресцентных и ретиналь-содержащих белков при поглощении некоррелированных и коррелированных (запутанных) фотонных пар. Впервые предложен общий формализм для расчета вероятностей переходов в случае поглощения запутанных и классических фотонных пар в случае фотоактивных молекулярных систем, в которых доминируют каналы возбуждения через постоянные диполи. Показано, что значительное усиление двухфотонного поглощения за счет квантового запутывания наблюдается как во флуоресцентных, так и ретиналь-содержащих белках. Это связано с наличием заряженных хромофорных групп, стабилизированных ближайшим белковым окружением. Большие величины постоянных дипольных моментов активных центров этих фотоактивных белков как в основном, так и возбужденном состоянии, а также сонаправленность соответствующих векторов важны для усиления поглощения запутанных пар фотонов, сечение которого зависит как от классического, так и неклассического вклада. При этом классический вклад определяется разницей постоянных дипольных моментов, тогда как неклассический вклад зависит от их суммы. Сильно полярный активный центр приводит к усилению двухфотонного поглощения за счет запутывания фотонов на 2 порядка, при этом усиление сильнее для флуоресцентных белков, в которых происходит существенно меньший перенос заряда при возбуждении по сравнению с ретиналь-содержащими белками первого и второго типов, и классический вклад оказывается много меньше неклассического аналога. Показано, что локальное электрическое поле белка может по-разному влиять на поглощение классических и запутанных фотонных пар, что наблюдается в случае точечной мутации T203I в белке EGFP. 4. Проведены исследования двухфотонного поглощения флуоресцентных белков в ближних электромагнитных полях плазмонных наночастиц металлов при их резонансном возбуждении. При разработке метода получения плазмонных наночастиц с заданной формой на основе модификации метода коллоидной литографии получены хиральные наночастицы серебра, имеющие значительный сигнал кругового дихроизма в области ближнего ИК излучения. Установлено значительное увеличение сечения двухфотонного поглощения вблизи плазмонных наночастиц с формой полумесяца. 5. В ходе совместных экспериментальных и теоретических работ изучена роль электронно-колебательных взаимодействий в механизме окислительной фотоконверсии флуоресцентных белков, сопровождающейся сдвигом максимумов длин волн поглощения и испускания в красную сторону. Определена зависимость квантового выхода фотоконверсии от длины волны возбуждения в различных режимах. Показано, что неравновесная заселенность колебательных уровней в состоянии S1 зависит от режима возбуждения. Активная мода с частотой 1614 см^-1, участвующая в переносе электрона из состояния S1, отвечает большему вибронному взаимодействию при классическом двухфотонном возбуждении, что способствует увеличению константы скорости фотопереноса электрона и повышению эффективности окислительной фотоконверсии белка EGFP.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".

Прикрепленные файлы

№ Имя Описание Имя файла Размер Добавлен