ИСТИНА

Целью данного проекта является синтез и скрининг биологической активности новых производных спирооксиндола, содержащих фармакофорные группы, необходимые для связывания с белками, выполняющими ключевую функцию в регуляции апоптоза - с MDM2/MDMX и тубулином. Таким образом, целью проекта будет являться синтез новых спирооксиндолов и производных диазобициклононана, потенциально сочетающих противораковые свойства с другими благоприятными при данной терапии эффектами - анальгетическим и противовоспалительным и проведение первичного доклинического скрининга их биологической активности.

The aim of this project is the synthesis and screening of the biological activity of new spirooxindole derivatives containing pharmacophore groups necessary for binding to proteins that perform a key function in the regulation of apoptosis - MDM2/MDMX and tubulin. Thus, the goal of the project will be the synthesis of new spirooxindoles, potentially combining anticancer properties with other effects favorable for this therapy - analgesic and anti-inflammatory, and conducting a primary preclinical screening of their biological activity.

Предполагается использовать методологию [3+2] циклоприсоединения для создания новых производных спирооксиндолов,сочетающих противоопухолевые и антиокислительные свойства. Таким образом предполагается получить новые конформационно ограниченные низкомолекулярные ингибиторы белок-белковых взаимодействий, вызывающие гибель раковых клеток посредством апоптоза: ингибиторы взаимодействия p53-MDM2\MDMX и соединения, нарушающие процесс полимеризации тубулина. Молекула спирооксиндола является удобной платформой для целевых модификаций и, благодаря введению дополнительных функций, позволяет существенно улучшить не только антиокислительные свойства и связанные с ними противовоспалительные свойства, но и растворимость полученных производных в воде, что важно при создании лекарственных форм.

Авторским коллективом было впервые показано, что простейшие алкокси-содержащие цис-2,4,5-триарилимидазолины являются аналогами нутлина, причем замена хлора на алкокси-группу не приводит к потере способности ингибировать MDM2-р53 взаимодействие и вызывать апоптоз раковых клеток, не провоцируя при этом их некроз. В дальнейшем исследовании было показано, что ведение сульфонильной группы позволило значительно повысить растворимость цис-имидазолинов с сохранением их цитотоксичности. Биологическую активность полученных сульфонил-содержащих имидазолинов изучали методом Вестерн-блоттинга на линиях раковых клеток A549, RKO и SH-SY5Y. Было показано, что производные способны ингибировать взаимодействие MDM2 / MDMX-p53, способствовать стабилизации p53 и индуцировать экспрессию p21 в концентрациях от 0,5 мкМ. Ранее коллективом были получены упрощенные структуры на основе адамантановых и 8-оксабицикло [3.2.1]октановых каркасов, содержащие фармакофорные части паклитаксела и элеутеробина. Показано,что данные соединения в микромолярных концентрациях выбранные аналоги влияли на динамику тубулина in vitro и в живом организме и были цитотоксичными в отношении линий опухолевых клеток человека.Для преодоления метаболической нестабильности противоракового соединения 2-метоксиэстрадиола были синтезированы дихлорацетилированные пролекарства на его основе и оценена их биологическая активность in vitro на штаммах раковых клеток A549 и MCF-7. Авторским коллективом также ранее велись разработки в области химии арилиденоксиндолов, являющихся исходными соединениями для синтеза целевых спирооксиндолов.

Проведено молекулярное моделирования связывания ряда спирооксиндолов с активными сайтами белков MDM2 и MDMX. Выявлены структурные различия белков MDM2 и MDMX, которые делают сайт связывания в MDMX меньшим по размеру и менее подходящим для спирооксиндольных лигандов. Продемонстрирована возможность введения дополнительного заместителя в спирооксиндол, располагающегося таким образом, чтобы быть направленным из сайта связывания наружу, и не оказывать принципиального влияния на ключевые связывания спирооксиндольного каркаса с белком. Таким образом, это положение может быть использовано для дополнительной функционализации молекулы, например, для увеличения ее водорастворимости или введения групп, обеспечивающих таргетное действие по отношению к раковым клеткам. Показана возможность замены атомов Hal в оксиндольном каркасе на метокси-группу без потери аффинности к MDM2. Таким образом, в результате молекулярного моделирования были выявлены основные направления модификаций, которые могут привести к значительному повышению растворимости целевых соединений в воде при сохранении их целевой активности. Был проведен поиск новых мультиориентированных соединений, сочетающих в себе противораковые свойства с антиоксидантными и обладающие повышенной растворимостью в воде, что важно при разработке лекарственных препаратов с повышенной биодоступностью. Был разработан протокол конструирования молекул с заданной стереохимией с пошаговым разносторонним изучением активности собранного фрагмента на каждом шаге, задающем конфигурацию фармакофорных групп. Одним из таких ключевых шагов, определяющих пространственное расположение важных для связывания с белками групп, является сборка арилиденоксиндолов определенной конфигурации. Нами был разработан критерий, позволяющий на основании спектроскопии ядерного магнитного резонанса определять конфигурацию двойной связи в арилиденоксиндолах. Показано, что эта конфигурация определяется расположением заместителей в оксиндольном кольце: при наличии групп в положении 4 преимущественно образуется Z-изомер, в то время как в случае заместителей в положениях 5 и 6 оксиндольного цикла преобладает транс-конфигурация двойной связи. Среди 6-замещенных арилиденоксиндолов выявлены соединения, обладающие цитотоксичностью, превышающей активность цисплатина в сочетании со способностью ингибировать перекисное окисление липидов. Предварительное изучение возможного механизма их противоракового действия показало, что соединения, содержащие заместитель в положении 6 оксиндольного цикла, не влияют на активность фермента хинон оксидоредуктаза II, однако способны нарушать процессы сборки микротрубочек. Активность 5-замещенных арилиденоксиндолов также была изучена нами совместно с ВолгГМУ. Нами было впервые показано, что 3-арилиденпроизводные оксиндола они могут являться ингибиторами человеческой NRH:хиноноксидоредуктазы (NQO2). Было установлено, что наличие двойной связи необходимо для целевой активности. Наиболее активные соединения также содержат ОН-группу в арилиденовой части. Добавление ациламино- или карбамоиламиногруппы может увеличить ингибирующую активность соединения, но наиболее значительный эффект вызывает добавление метильной группы к амидному азоту оксиндольного кольца. Выявлены соединения, проявляющие ингибирующую активность по отношению к NQO2 с IC50 около 0,3 μM. Таким образом, можно предположить, что цитотоксичное действие 6-замещенных арилиденоксиндолов в первую очередь связано с их влиянием на полимеризацию тубулина. Поскольку для раковых клеток характерно быстрое деление, в котором участвует тубулин, нарушение динамического равновесия полимеризации-деполимеризации тубулина приводит к тому, что деление раковой клетки оказывается заторможенным в одной из фаз митоза. Это приводит либо к остановке деления клетки, либо к запуску механизма апоптоза. Еще одной потенциальной мишенью при терапии рака является фермент киназа гликогенсинтазы 3 бета. Этот фермент задействован в большом количестве сигнальных путей и процессов, поэтому изучение разностороннего влияния ее ингибиторов на организм является важной задачей при поиске новых противораковых препаратов. Для производных арилиденоксиндолов, проявляющих ингибирующую активность по отношению к киназе гликогенсинтазы 3 бета, была изучена их способность уменьшать тромбообразование. Совместно с коллегами из ВолгГМУ нами были найдены соединения, обладающие выраженным антикоагуляционным эффектом, превышающим эффект аспирина как in vitro, так и in vivo. Наибольший эффект показало соединение, являющееся наномолярным ингибитором киназы гликозенсинтазы 3 бета (IC50 4 нМ), которое превосходит активность аспирина на крысиной модели индуцированного тромбоза в 18,7 раз. С использованием синтезированных нами арилиденоксиндолов разработан препаративный метод синтеза новых энантиомерно чистых производных спирооксиндолов с использованием хирального вспомогательного агента в реакции диполярного присоединения. Показано, что наличие алкокси-групп в ароматических кольцах арилиденоксиндолов негативно сказывается на их реакционной способности в реакциях диполярного присоединения. Как основной спирооксиндольный каркас для дальнейшей модификации были выбраны оптически активные производные, обладающие способностью ингибировать МДМ2-р53 взаимодействие в наномолярном диапазоне и вызывать апоптоз в раковых клетках, но при этом плохо растворимое в воде, что затрудняет его применение в клинической практике. Было опробовано два подхода к модификации подобных молекул и предложена оптимальная схема, позволяющая получать целевые структуры в энантиомерно чистом виде. Было проведено две модификации данного каркаса, позволяющие вводить как фрагмент, значительно увеличивающий растворимость в воде, так и фрагмент, обладающий свойствами лиганда простат-специфичного мембранного антигена (PSMA), который не только значительно увеличивает растворимость спирооксиндола в воде, но и должен увеличивать селективность соединения по отношению к клеткам рака простаты в сравнении со здоровыми клетками. Предварительное тестирование показало, что данные соединения обладают повышенной растворимостью как в органических растворителях, так и в воде в сравнении с исходным немодифицированным спирооксиндолом.