ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИСТИНА ПсковГУ |
||
Структурная характеристика новых неканонических белков - SerP38 и гомолога SerPH122.
The project is devoted to a comprehensive study of the non-canonical serine peptidase of Tenebrio molitor - SerP38 and the homolog of the serine peptidase SerPH122. Serine peptidases of the S1 family of chymotrypsin represent a large group of digestive enzymes of insects from the Tenebrionidae family. They are characterized by high levels of mRNA expression and high specific activity. Analysis of transcriptome from T. molitor larvae revealed the highly expressed digestive peptidase SerP38. SerP38 has a classic active site His-Asp-Ser, but an unusual S1-substrate-binding subsite - Gly-Gly-Asp, previously identified only in a small number of arthropod enzymes (Arthropoda), which causes scientific interest in its study. In addition to active serine peptidases of the S1 family, there are a number of homologs containing substitutions in the amino acid residues of the active center. Substitutions of key amino acid residues can lead to a lack of catalytic activity, although in some cases, low activity remains. At present, there is very little information about the functions of homologs. It is considered that they can take part in the regulation of active peptidases, acting as partner proteins. Recent studies indicate that a large number of homologs are characteristic of insects, which makes them and, in particular, T. molitor, which is a good biochemical model, a convenient object for studying the spectrum and properties of these homologs. In the transcriptome from the T. molitor larvae gut, we identified SerPH122 (GenBank MW882981), a protein-homolog of serine peptidases from the S1 family of chymotrypsin with a high level of expression. SerPH122 contains the replacement of the key Ser by Thr residue in the active site (His-Asp-Thr instead of the classical His-Asp-Ser), but retained a low reliably detectable activity of the chymotrypsin type. Previously, these homologs have not been studied.
Получение большего количества рекомбинантных пробелков. В результате разработки условий, обеспечивающих получение SerP38 без про-домена получить активную пептидазу. Биохимическая характеристика позволит подобрать оптимальные условия работы с ферментом и гомологом. В результате исследования способности SerP38 гидролизовать коллаген ожидается установить возможность использования SerP38 для расщепления подобных трудногидролизуемых белков.
Научный коллектив имеет большой опыт работы по изучению протеолитических ферментов и их использованию для решения прикладных задач, изучает пищеварительные пептидазы и организацию пищеварительного протеолиза у насекомых с использованием биоинформатических, генно-инженерных и биохимических подходов. С использованием биоинформатических методов впервые был проведен анализ последовательностей сериновых пептидаз и их гомологов семейства S1 химотрипсина в транскриптоме T. molitor и определены наборы последовательностей сериновых пептидаз. В результате исследований базы кДНК T. molitor было собрано 196 последовательностей транскриптов белков, гомологичных сериновым пептидазам семейства S1 химотрипсина. Активный центр, соответствующий сериновым пептидазам His-Asp-Ser, имели 97 последовательностей. Остальные 99 содержали замены на другие аминокислоты в активном центре и, таким образом, являлись гомологами сериновых пептидаз. При участии членов научного коллектива разработан метод получения рекомбинантного профермента SerP38 в дрожжевой системе K. kurtzmanii [Горбунов и др, 2020. Биотехнология, 36(6):78-86]. Получен рекомбинантный белок-гомолог сериновых пептидаз proSerPH122 T. molitor, показано, что полученный гомолог проявляет невысокую химотрипсин-подобную активность. Двое участников научного коллектива имеют опыт совместной реализации проекта РНФ № 19-74-00080, 2019-2021 (Терещенкова В.Ф. – руководитель, Жиганов Н.И. – исполнитель).
1. Накоплены необходимые для биохимических экспериментов количества рекомбинантных препаратов пробелков. Протестированы и подобраны условия культивирования для повышения секреции. 2. Протестированы условия процессинга препаратов рекомбинантных пробелков. Показано, что рН-оптимумы пептидазы SerP38 и гомолога SerPH122 находятся в области рН 8-9. Изучена субстратная специфичность пептидазы SerP38 и гомолога SerPH122. 3. Проведено сравнение стабильности препаратов T. molitor. 4. Разработаны условия стабилизации зрелой формы пептидазы SerP38. 5. Протестировано действие пептидазы SerP38 на коллаген I типа из быка. 6. Изучена локализации белков в кишечнике личинок T. molitor. 7. Проведен скрининг условий кристаллизации пробелка proSerPH122. 8. Проведено моделирование трехмерной структуры для гомолога и активной сериновой пептидазы.
грант РНФ |
# | Сроки | Название |
1 | 16 декабря 2021 г.-31 декабря 2022 г. | Структурное изучение неканонических сериновых пептидаз и их гомологов из семейства S1 химотрипсина у насекомого Tenebrio molitor |
Результаты этапа: В результате реализации первого этапа проекта накоплены необходимые для биохимических экспериментов количества рекомбинантных препаратов (по 2 мг) профермента сериновой пептидазы SerP38 и пробелка гомолога сериновых пептидаз SerPH122 T. molitor. Установлена возможность получения необходимых количеств рекомбинантных препаратов путем масштабирования разработанных методик. Протестированы и подобраны условия культивирования для повышения секреции. Разработаны условия для получения SerP38 без про-области. Подобраны условия процессинга препаратов рекомбинантных пробелков SerP38 и SerPH122: оптимальное время процессинга трипсином. Была изучена субстратная специфичность пептидазы SerP38 и гомолога SerPH122. Был проведен анализ влияния ингибиторов. Были проанализированы условия кристаллизации для имеющихся в базе данных RCSB PDB кристаллических структур, гомологичных для SerP38 и SerPH122. В результате было показано, что в первую очередь целесообразно попробовать кристаллизацию белков методом диффузии паров растворителя в варианте сидячей или висящей капли, используя сульфат аммония, цитрат и ацетат натрия и полиэтиленгликоли в качестве осадителей. Результаты работ по проекту были доложены на XVI съезде Русского энтомологического общества 22-26 августа 2022, Москва и опубликованы в сборнике тезисов: Жиганов Н.И., Терещенкова В.Ф., Винокуров К.С., Беляева Н.В., Филиппова И.Ю., Элпидина Е.Н. Разнообразие сериновых пептидаз у жуков семейства Tenebrionidae (Coleoptera). XVI съезд Русского энтомологического общества. Москва, 22–26 августа 2022 г. Тезисы докладов. 164 с. 2022. ООО «Товарищество научных изданий КМК», Москва, с. 76. doi: 10.5281/zenodo.6976546. План проекта на этапе 2022 г. выполнен полностью. | ||
2 | 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. | Структурное изучение неканонических сериновых пептидаз и их гомологов из семейства S1 химотрипсина у насекомого Tenebrio molitor |
Результаты этапа: 1. Накоплены необходимые для биохимических экспериментов количества рекомбинантных препаратов пробелков. Протестированы и подобраны условия культивирования для повышения секреции. 2. Протестированы условия процессинга препаратов рекомбинантных пробелков. Показано, что рН-оптимумы пептидазы SerP38 и гомолога SerPH122 находятся в области рН 8-9. Изучена субстратная специфичность пептидазы SerP38 и гомолога SerPH122. 3. Проведено сравнение стабильности препаратов T. molitor. 4. Разработаны условия стабилизации зрелой формы пептидазы SerP38. 5. Протестировано действие пептидазы SerP38 на коллаген I типа из быка. 6. Изучена локализации белков в кишечнике личинок T. molitor. 7. Проведен скрининг условий кристаллизации пробелка proSerPH122. 8. Проведено моделирование трехмерной структуры для гомолога и активной сериновой пептидазы. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".