ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИСТИНА ПсковГУ |
||
Создание новых функционализированных субфталоцианинов бора, получение на их основе коньюгатов с наноматериалами (TiO2, наночастицы золота) для использования в качестве фотосенсибилизаторов и флуоресцентных меток в тераностике онкологических заболеваний.
According to the World Health Organization, oncological diseases are one of the key factors of death in the world. Well-timed diagnosis and treatment in the early stages of the disease increases the chances of remission and reduces the likelihood of disease recurrence. An active area of cancer therapy is photodynamic therapy (PDT) - light-activated chemotherapy. The PDT method in oncology is widespread in Moscow. This type of treatment is carried out at the Center for Laser and Photodynamic Diagnostics and Therapy of Tumors of Moscow Oncological Institute P. A. Herzen - branch of the Federal State Budgetary Institution "NMITs of Radiology" of the Ministry of Health of Russia; N.N. Blokhin Russian Cancer Research Centre; Department of Laser Oncology and Photodynamic Therapy of O.K. Skobelkin State Scientific Center of Laser Medicine under the Federal Medical Biological Agency; clinic of Central Clinical Hospital of the Russian Academy of Sciences. In this regard, the search for new compounds that can be used in the PDT method simultaneously as a photosensitizer for the generation of reactive oxygen species and visualization of tumor cells is acquiring high importance and relevance. This approach meets the principles of a new direction - theranostics, which combines diagnostics, targeted therapy, and monitoring of treatment results. This Project is devoted to the development of directed methods for the synthesis of new candidates for PDT agents - boron subphthalocyanines containing functional groups, and the subsequent preparation of conjugates with nanomaterials (TiO2, gold nanoparticles) on their basis. The study of photochemical properties (yields of generation of reactive oxygen species, quantum yields of fluorescence) will make it possible to select hit compounds that are promising for use as photosensitizers and fluorescent labels in theranostics of oncological diseases. Boron subphthalocyanines and their structural analogs have great potential for the theranostics of oncological diseases. The generation yields of singlet oxygen of subphthalocyanines are high (up to 70-80%), in solutions they are not prone to aggregation, due to the non-planar conical shape of the molecule. Unlike related phthalocyanines, subphthalocyanines are characterized by intense fluorescence in the visible range of 500-600 nm (fluorescence quantum yields of about 20%), which can be used for visualization of tumor cells.
На первом этапе выполнения Проекта с использованием реакции кросс-сочетания по Соногашира будут получены о-фталонитрилы, содержащие в качестве заместителей непредельные спирты с различной длиной алифатической цепи (в качестве спиртов будут использованы пропаргиловый спирт, бутин-1-ол, гексин-1-ол). На основе данных нитрилов будут получены соответствующие замещенные субфталоцианины бора. Данные соединения также будут синтезированы с использованием альтернативного подхода путем функционализации субфталоцианинового макрокольца. В обоих случаях дополнительно будет произведена функционализация аксиального положения. Затем концевая гидроксигруппа будет преобразована в тиольную для дальнейшего прививания на поверхность наночастиц золота. Будет получена серия субциклазиноцианиновых комплексов бора с различными заместителями и проведена функционализация производными бензойной кислоты по аксиальному положению. Таким образом, на первом этапе планируется получить серию субфталоцианинов бора, содержащих функциональные группы как по периферии макрокольца, так и по аксиальному положению (Схема 1). На втором этапе выполнения Проекта будут определены фотохимические характеристики индивидуальных субфталоцианинов и отобраны субфталоцианины с лучшим соотношением квантового выхода флуоресценции и генерации активных форм кислорода. Будут получены гибридные образцы TiO2 и наночастиц Au, стабилизированных оболочкой из субфталоцианинов. Будут определены фотохимические характеристики индивидуальных субфталоцианинов. Для гибридных материалов и индивидуальных субфталоцианинов будет исследована цитотоксичность по отношению к клеточным линиям (SW480, A549, MCF7, MCF7D и др.). Таким образом, по окончании проекта будут получены активные фотосенсибилизаторы на основе субфталоцианинов, перспективные для тераностики онкологических заболеваний, т.е. способные визуализировать клетки опухоли (за счёт флуоресценции) и обладать фотоцитотоксичностью за счёт генерации активных форм кислорода.
Руководителем Проекта было показано, что арил- и арилоксизамещенные субфталоцианины бора обладают высокими выходами флуоресценции (10-15%). Обнаружено, что наличие «тяжелого» атома брома в аксиальном положении субфталоцианина приводит к уменьшению выхода флуоресценции по сравнению с хлорзамещенными аналогами. Показано, что сечения поглощения возбужденных состояний и эффективные времена жизни высоколежащих возбужденных состояний (пикосекундные времена жизни высоколежащих возбужденных состояний и величина сечения поглощения первого возбужденного состояния около 10-17см2) субфталоцианиновых комплексов сопоставимы с фталоцианином алюминия. Полученные ранее руководителем Проекта галоген-замещенные (фтор и хлор), алкил-, арил- и арилоксизамещенные субфталоцианиновые комплексы были протестированы на предмет эффективности генерации синглетного кислорода [ChemPhotoChem., 2020, 4, 300–306]. Научным коллективом отработаны методики и проведены исследования генерации синглетного кислорода с использованием ловушки для фталоцианинов, а также измерений спектров флуоресценции и возбуждения флуоресценции [IOP Conf. Series: Materials Science and Engineering, 2019, 525, 012027], разработаны синтетические методы введения различных функциональных групп в о-фталонитрилы и синтеза фталоцианиновых комплексов с использованием темплатного метода [New J. Chem., 2020, 44, 7849-7857]. Участниками научного коллектива разработан подход для конструирования гибридных комплексов металлов, содержащих в качестве лигандов миметики витамина Е, фотосенсибилизатор – бактериохлорин, холиевые кислоты.
Широкий спектр замещенных субфталоцианинов бора был протестирован как многообещающие кандидаты для тераностики рака. Целевые субфталоцианины демонстрируют высокие выходы генерации синглетного кислорода ΦΔ = 0.47÷0.85 и яркой флуоресценции Φf = 0.13÷0.50. Присутствие тяжелого атома йода увеличивает квантовый выход синглетного кислорода, но одновременно снижает выход флуоресценции. Эти результаты согласуются с кинетикой затухания флуоресценции. Для йодированного субфталоцианина быстрый интеркомбинационный переход приводил к короткому времени жизни флуоресценции (0.3 нс) и, как следствие, низкому значению Φf . Субфталоцианины продемонстрировали эффективное взаимодействие с сайтом связывания сывороточного альбумина человека, вероятно, благодаря гидрофобным взаимодействиям. Значения констант связывания сравнимы с константами, полученными ранее для водорастворимых фталоцианинов. Данные конфокальной микроскопии показали накопление замещенных субфталоцианинов в митохондриях и эндоплазматическом ретикулуме. Изучение темновой и фотоиндуцированной цитотоксичности позволило выбрать два активных соединения (трет-бутил- и йодзамещенные субфталоцианины бора) с низкой темновой и высокой фототоксичностью (IC50=1.2 и 7.0 мкМ соответственно). Примечательно, что фототоксичность трет-бутилзамещенного соединения в 1.6 раза выше, чем у известного фотосенсибилизатора бенгальского розового, недавно вступившего во II фазу клинических испытаний для лечения меланомы.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 4 апреля 2021 г.-15 ноября 2021 г. | Синтез и фотохимические свойства новых субфталоцианинов бора – перспективных соединений для тераностики онкологических заболеваний |
Результаты этапа: В рамках первого этапа выполнения Проекта осуществлена разработка методов синтеза субфталоцианинов бора, содержащих функциональные группы по периферии макрокольца и в аксиальном положении. Для полученных соединений изучены фотохимические характеристики (выход генерации синглетного кислорода, выходы флуоресценции). Проведен скрининг темновой цитотоксичности новых соединений с применением МТТ теста на трёх клеточных линиях меланом (Colo679, Colo849 и BRO). В результате проведенного исследования выделены наиболее перспективные для целей тераностики (фотодинамическая терапия+флуоресцентная диагностика) субфталоцианины бора. 1. Синтез функционально замещенных субфталоцианинов бора Субфталоцианиновое макрокольцо формировалось темплатным методом в высококипящем растворителе в присутствии тригалогенидов бора (BCl3 или BBr3). Введение периферических групп осуществлялось двумя способами: (1) путём получения субфталоцианинов из функционально-замещенных о-фталонитрилов и (2) методом постсинтетической модификации, когда периферические группы модифицировались в уже сформированном субфталоцианине. С использованием первого подхода получены субфталоцианиновые комплексы 2a-h. Наилучших выходов удалось достичь за счёт использования кипящего о-дихлорбензола (о-ДХБ) в качестве среды протекания реакции. Однако для синтеза фенил-замещенного комплекса наиболее приемлемым в качестве растворителя оказался кипящий пара-ксилол. Использование о-ДХБ привело к получению следовых количеств субфталоцианина 2f. Для получения субфталоцианиновых комплекcов 2b и 2g исполнителями Проекта Моисеевой Е.О. и Горбуновой Е.А. предварительно синтезированы соответствующие фталонитрилы. При получении 4-йод-фталонитрила 1b использовалась модифицированная методика диазотирования/йодирования в присутствии п-толуолсульфокислоты (p-TsOH) в среде ацетонитрила (Схема 2). Данный метод впервые применяется для синтеза галоген-замещенных фталонитрилов. Основными его преимуществами является то, что реакция проходит при комнатной температуре и позволяет получить целевое соединение с выходом 80% без проведения очистки методом колоночной хроматографии. Данный выход на 10% выше полученного в литературе при использовании классической методики диазотирования/йодирования [Can J Chem, 1985, 63, 3057]. Для получения 4-(карбоэтокси)фенил замещенного о-фталонитрила использовали реакцию нуклеофильного замещения, которая протекает достаточно легко (90оС, выход – 81%) для активированного электронокцепторными цианогруппами группами субстрата – 4,5-дихлор-фталонитрила. Таким образом, получены субфталоцианины бора, содержащие как электронодонорные (алкил-, фенил-, фенокси-), так и электроноакцепторные (4-(карбоэтокси)фенил-, галоген-) функциональные группы. Фенокси-замещенный субфталоцианин бора использован в качестве объекта для поиска оптимальных условий замены аксиального лиганда. Замена аксиального атома хлора на феноксигруппу производилась в две стадии. Сначала осуществлялась замена хлора на легкоуходящий трифторметансульфонат (OTf). Затем, без предварительного выделения трифлат-замещенного субфталоцианина, вводилась феноксигруппы в присутствии третичного амина – диизопропилэтиламина (DIPEA) в качестве основания (Схема 3). Исполнителями Проекта Косовым А.Д. и Моисеевой Е.О. проверены два возможных пути введения в молекулу субфталоцианина структурных фрагментов, содержащих гидрокси-группы, с целью получения прекурсоров для синтеза гибридных материалов. Получение самих гибридных материалов на основе субфталоцианинов и диоксида титана, а также субфталоцианинов и наночастиц золота запланировано осуществить на втором этапе выполнения Проекта. Первый путь заключался в проведении реакции Соногашира между пропаргиловым спиртом и 4-йод-фталонитрилом, и последующей попытке синтеза субфталоцианинового комплекса (Схема 4). Синтез проводили в среде ТГФ и триэтиламина при комнатной температуре, в качестве катализаторов использовались иодид меди(I) и дихлоробис(трифенилфосфин) палладий. Обнаружено, что полученный нитрил не вступает в макроциклизацию в присутствии тригалогенидов бора и не образует субфталоцианиновый комплекс. Это можно объяснить тем, что терминальная гидрокси-группа способна при высокой температуре (180оС для кипящего о-ДХБ или 139оС для п-ксилола) за счёт нуклеофильной атаки раскрывать субфталоцианиновое макрокольцо с образованием линейного полимера. В связи с этим было принято решение вводить 3-гидроксипроп-1-ин-1-ильную группу непосредственно в субфталоцианин. Для того чтобы избежать протекания реакции аксиального замещения по атому бора (пример такой реакции приведен в работе [J. Porphyrins Phthalocyanines, 2017; 21: 539–546]), предварительно провели введение защитной феноксигруппы. Полученный трийод-субфталоцианина бора фенолят был введен в реакцию кросс-сочетания Соногашира с пропаргиловым спиртом в присутствии триэтиламина в качестве основания, тетракис(трифинилфосфина) палладия (0) и йодида меди (I) в качестве катализаторов. Полученный субфталоцианин с терминальными гидроксигруппами по периферии макрокольца ввели в реакцию замещения с метансульфонилхлоридом. Данная защитная группа выбрана для того, чтобы на втором этапе выполнения Проекта возможно было получить меркапто-производное по соседству с тройной связью. Данные субфталоцианины будут использованы для получения гибридных наночастиц на втором этапе выполнения Проекта. Непредельные спирты вводились не только в периферические положения субфталоцианинов, но и в аксиальное. В данном случае осуществлялась замена аксиального атома брома. Реакция проходила достаточно легко, и не потребовалось вводить трифторметансульфонат, в качестве легкоуходящей группы. В качестве аксиальных заместителей, для изучения взаимосвязи структура комплексов-фотохимические свойства выбраны непредельные спирты с различной длинной алкильной цепочки, связывающей гидроксигруппу и тройную связь: пропаргиловый спирт, 3-бутин-1-ол и 5-гексин-1-ол (схема 5). Выходы целевых соединений составляли 60-70%. Стоит отметить, что длина углеводородной цепочки в аксиальном лиганде практически не влияет на положение максимума в спектре поглощения полученных субфталоцианинов. Протестирован метод введения защищенной тиольной группы (тиоацетатной группы) через стадию получения тозилата (схема 6). Целевой нитрил получен с достаточно высоким выходом и будет использован на втором этапе выполнения Проекта для синтеза гибридных наночастиц золота, ковалентно связанных с молекулами субфталоцианинов. С целью получения субфталоцианинов, обладающих расширенной ароматической системой и соответственно поглощением смещенным в область терапевтического окна (600-800 нм) Дубининой Т.В и Косовым А.Д. получена серия новых субциклазиноцианинов бора (Схема 7). Полученные субциклазиноцианины бора обладают интенсивным поглощением смещённым до 680 нм относительно субфталоцианинов и субнафталоцианинов (Рис.1). Максимум поглощения смещается батохромно при переходе от метил-замещенного соединений к пропил-замещенному. Полученные результаты опубликованы в виде тезиса доклада международной конференции XII International Conference on Chemistry for Young Scientists "Mendeleev 2021" (Дубинина Т.В., устный доклад). 2. Фотохимические свойства функционально замещенных субфталоцианинов бора Полученные в рамках первого этапа выполнения Проекта субфталоцианины бора обладают высокой растворимостью в большинстве органических растворителей. Они растворимы, в том числе в спиртах, ацетонитриле и ДМСО. Например, молярные коэффициенты поглощения, определенные для растворов субфталоцианинов в ацетонитриле находятся в диапазоне 4.10˂lgε˂4.87. Можно выделить следующие закономерности для спектров поглощения целевых субфталоцианинов: при переходе от гексайод- (литературные данные [Chemistry – A European Journal, 2018, 24, 64, 17080-17090]) к гексахлор- и далее к гексафтор-замещенному субфталоцианину наблюдается гипсохромный сдвиг основного максимума поглощения (Q полосы): l6SubPcBCl (584нм) ˂ Cl6SubPcBCl (569нм) ˂ F6SubPcBCl (549нм). Это вероятно обусловлено сильным отрицательным индуктивным эффектом атомов фтора, вызывающим стабилизацию ВЗМО орбитали комплекса F6SubPcBCl и соответственно увеличение разницы энергий ВЗМО и НСМО, что в свою очередь и приводит к гипсохромному смещению Q полосы. Замена аксиального лиганда практически не влияет на положение максимума поглощения субфталоцианинов, что можно заметить на примере комплексов PhOSubPcBCl и PhOSubPcBOPh (Таблица 1). Введение карбоксильной группы в пара-положение фенольного фрагмента также практически не смещает максимума поглощения соединения EtOOCC6H4OSubPcBCl относительно гексафенокси-замещенного субфталоцианина PhOSubPcBCl. Это вызвано тем, что электроноакцепторная группа (карбоэтокси-) находится достаточно далеко от субфталоцианинового макрокольца. Наиболее сильный батохромный сдвиг Q полосы полосы наблюдается для фенил-замещенного субфталоцианина бора, максимум поглощения которого расположен при 582нм. Это связано с дестабилизацией ВЗМО субфталоцианина за счёт вклада периферических ароматических заместителей (фенильных групп), имеющих жёсткую С-С связь с макрокольцом. Значения квантовых выходов флуоресценции исследуемых субфталоцианинов бора достаточно велики (0.13˂Φf˂0.50). Однако в случае трийод-замещенного субфталоцианина I3SubPcBCl флуоресценция заметно меньше (Φf=0.02) из-за эффекта тяжелого атома (происходит быстрая интеркомбинационная конверсия). Похожая ситуация наблюдалась в литературе для гексайод-замещенных субфталоцианинов I6SubPcBCl и I6SubPcBX, для которых значения Φf в 10 раз меньше, чем у синтезированного нами трийод-замещенного субфталоцианина (Таблица 1). Самый высокий выход флуоресценции (Φf=0.50) наблюдается для субфталоцианина, содержащего по периферии макрокольца 4-карбоэтокси-фенильные заместители EtOOCC6H4OSubPcBCl. Похожие значения представлены в литературе для нитро-замещенного субфталоцианина ((NO2)3SubPcBOPh) и незамещенного с аксиальным атомом фтора (SubPcBF). Более высокие значения флуоресценции отмечены только в случае додека-замещенного субфталоцианина (CF3CH2O)12SubPcBCl [Chem. Eur. J. 2010, 16, 7554]. Стоксов сдвиг максимумов флуоресценции небольшой и составляет около 10-20 нм (Рис.2, Таблица 1), что соответствует приводимым в литературе данным для других аналогов субфталоцианинов [Chem. Rev. 2014, 114, 2192−2277]. 3. Определение выходов генерации синглетного кислорода Для исследуемых соединений определены квантовые выходы генерации синглетного кислорода (ΦΔ). Использовался метод, включающий в себя определение интенсивности люминесценции синглетного кислорода в ближней ИК области, в толуоле при λex=513 нм (Рис. 3). Показано, что полученные в рамках выполнения настоящего Проекта субфталоцианины бора генерируют синглетный кислород с высокой эффективностью (Таблица 2). Выходы синглетного кислорода для всего ряда субфталоцианинов (0.47˂ΦΔ˂0.63) оказались сопоставимы со стандартом 5,10,15,20-тетрафенилпорфирином (ТРР). Как и ожидалось, наибольшее значение выхода генерации синглетного кислорода проявляется для трийод-замещенного субфталоцианина (ΦΔ=0.85). Это обусловлено увеличением времени жизни триплетного состояния за счёт наличия тяжёлых атомов йода. Похожие значения ΦΔ описаны в литературе для гексайод-замещенных комплексов. Для целей тераностики наиболее подходят субфталоцианины, сочетающие в себе качества хорошего флуорофора и эффективного фотосенсибилизатора. В связи с этим из полученных фотохимических данных можно сделать следующие выводы. Все полученные субфталоцианины продемонстрировали высокие выходы генерации синглетного кислорода (ΦΔ≥0.47) и являются перспективными фотосенсибилизаторами. Однако наиболее высокими выходами флуоресценции (Φf>0.20) обладают: карбоэтокси-замещенный комплекс EtOOCC6H4OSubPcBCl, фтор-замещенный субфталоцианин F6SubPcBCl, фенил-замещенный Ph6SubPcBCl, хлор-замещенный Cl6SubPcBCl и трет-бутил-замещенный tBuSubPcBCl. Йод-замещенный комплекс, несмотря на очень высокий выход генерации синглетного кислорода, флуоресцирует достаточно слабо, поэтому может рассматриваться только с позиций применения его в качестве фотосенсибилизатора. Полученные результаты опубликованы в сборнике тезисов докладов 5-й Российской конференции по медицинской химии с международным участием «МедХим-Россия 2021» (сама конференция перенесена на 2022 г из-за эпидемиологической ситуации в Волгограде). Готовится к публикации статья. 4. Определение темновой цитотоксичности субфталоцианинов бора Проведен скрининг темновой цитотоксичности новых соединений с применением МТТ теста на трёх клеточных линиях меланом (Colo679, Colo849 и BRO) (Таблица 3). Обнаружено, что практически для всех целевых соединений значения IC50 достаточно высоки, то есть они не проявляют темновой цитотоксичности по отношению к клеткам меланомы. Однако для фтор-замещенных комплексов наблюдается цитотоксичность при микромолярных концентрациях. Важно отметить, что цитотоксичность растёт при переходе от гексафтор- к октадекафтор-замещенному субфталоцианину. Вероятно, данное явление обусловлено увеличением биодоступности фторированных соединений и их лёгкого проникновения в клетки, по отношению к не содержащим фтора веществам. Возможное практическое применение Новые субфталоцианиновые комплексы бора, полученные в рамках выполнения настоящего Проекта, планируется использовать для тераностики (фотодинамическая терапия+флуоресцентная диагностика) онкологических заболеваний, например меланомы. В результате проведенного исследования выделены наиболее перспективные для целей тераностики субфталоцианины бора. Проверялось соответствие следующим критериям: субфталоцианины должны сочетать в себе качества яркого флуорофора (Φf>0.20) и эффективного фотосенсибилизатора способного к генерации активных форм кислорода. Для селективного действия фотосенсибилизаторов и, в особенности, для их использования в тераностике, важно, чтобы они обладали низкой темновой цитотоксичностью. Все полученные субфталоцианины продемонстрировали высокие выходы генерации синглетного кислорода (ΦΔ≥0.47) и являются перспективными фотосенсибилизаторами. Однако наиболее высокими выходами флуоресценции (Φf>0.20) и низкой темновой цитотоксичностью (IC50>10μM) обладают: (1)карбоэтокси-замещенный комплекс, (2)фенил-замещенный, (3)хлор-замещенный и (4)трет-бутил-замещенный. Трийод-замещенный комплекс, несмотря на очень высокий выход генерации синглетного кислорода (ΦΔ=0.85), флуоресцирует достаточно слабо, поэтому может рассматриваться только с позиций применения его в качестве фотосенсибилизатора для фотодинамической терапии. | ||
2 | 25 декабря 2021 г.-15 февраля 2023 г. | Синтез и фотохимические свойства новых субфталоцианинов бора – перспективных соединений для тераностики онкологических заболеваний |
Результаты этапа: Широкий спектр замещенных субфталоцианинов бора был протестирован как многообещающие кандидаты для тераностики рака. Целевые субфталоцианины демонстрируют высокие выходы генерации синглетного кислорода ΦΔ = 0.47÷0.85 и яркой флуоресценции Φf = 0.13÷0.50. Присутствие тяжелого атома йода увеличивает квантовый выход синглетного кислорода, но одновременно снижает выход флуоресценции. Эти результаты согласуются с кинетикой затухания флуоресценции. Для йодированного субфталоцианина быстрый интеркомбинационный переход приводил к короткому времени жизни флуоресценции (0.3 нс) и, как следствие, низкому значению Φf . Субфталоцианины продемонстрировали эффективное взаимодействие с сайтом связывания сывороточного альбумина человека, вероятно, благодаря гидрофобным взаимодействиям. Значения констант связывания сравнимы с константами, полученными ранее для водорастворимых фталоцианинов. Данные конфокальной микроскопии показали накопление замещенных субфталоцианинов в митохондриях и эндоплазматическом ретикулуме. Изучение темновой и фотоиндуцированной цитотоксичности позволило выбрать два активных соединения (трет-бутил- и йодзамещенные субфталоцианины бора) с низкой темновой и высокой фототоксичностью (IC50=1.2 и 7.0 мкМ соответственно). Примечательно, что фототоксичность трет-бутилзамещенного соединения в 1.6 раза выше, чем у известного фотосенсибилизатора бенгальского розового, недавно вступившего во II фазу клинических испытаний для лечения меланомы. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".
№ | Имя | Описание | Имя файла | Размер | Добавлен |
---|