ИСТИНА

Одной из приоритетных задач направления «Генетические технологии для медицины» является создание моделей заболеваний с использованием культур клеток и лабораторных животных. Создание моделей заболеваний требует понимания механизмов развития патологии, а именно генетических детерминант, обусловливающих возникновение заболевания. Настоящий проект ставит перед собой несколько задач, направленных как на создание моделей заболеваний уже известной этиологии, так и на выявление новых генетических детерминант и механизмов, лежащих в основе изменения гомеостаза клетки и, как следствие, развития патологических состояний. В проекте будет применен биоинформатический анализ генетических структур с целью выявления новых детерминант, определяющих развитие генетически обусловленных патологий, а также самые современные методы редактирования геномов, такие как инактивация и редактирование генов с помощью системы CRISPR/Cas9, внедрение генов с помощью транспозонов и лентивирусов, а также с помощью сайт-специфических рекомбиназ бактериофагов. Будут проведено сравнительное исследование и оптимизация нескольких методов редактирования генома. В работе, проводящейся совместно с индустриальным партнером проекта ЗАО «БИОКАД», с помощью инактивации гена фактора свертывания крови IX будет создана модель гемофилии, которую индустриальный партнер будет использовать для разработки метода генной терапии этого заболевания. В план исследований в ходе реализации настоящего проекта входят различные задачи, имеющие целью как изучение фундаментальных основ влияния структурных особенностей РНК на программы экспрессии генетической информации, так и создание моделей заболеваний с использованием лабораторных животных и культур клеток. Такой широкий подход позволит определить ключевые аспекты влияния структурных особенностей РНК на реализацию программы экспрессии генома, а также предложить подходы к направленной регуляции экспрессии как конкретных генов, так и программы экспрессии генома в целом.

One of the priority tasks of the program of "Genetic Technologies for Medicine" is the creation of models of diseases using cell cultures and laboratory animals. The creation of models of diseases requires an understanding of the mechanisms of pathology development, namely, the genetic determinants that cause the development of the disease. This project has several objectives aimed at both creating the models of diseases with already known etiology and identifying new genetic determinants and mechanisms that underlie changes in cell homeostasis and, as a consequence, the development of pathological processes. The project will use bioinformatics analysis of genetic structures in order to identify new determinants that cause the development of genetically determined pathologies, as well as the most modern methods of genome editing, such as inactivation and editing of genes using the CRISPR/Cas9 system, the introduction of genes using transposons and lentiviruses, and also using site-specific recombinases of bacteriophages. The comparison and optimization of several genome editing methods will be carried out. In the work carried out jointly with the industrial partner of the project CJSC “BIOCAD”, the inactivation of the coagulation factor IX gene will be done to create a model of hemophilia, which will be used by the industrial partner to develop a method of gene therapy for this disease. The research plan of this project includes various tasks aimed at both studying the fundamental bases of the influence of the structural features of RNA on the expression programs of genetic information and creating models of diseases using laboratory animals and cell cultures. Such a broad approach will make it possible to determine the key aspects of the influence of the structural features of RNA on the implementation of the genome expression program, as well as propose approaches to the directed regulation of the expression of both specific genes and the genome expression program as a whole.

В план исследований настоящего проекта входят различные задачи, имеющие целью как выявление новых генетических детерминант и механизмов, лежащих в основе изменения гомеостаза клетки и, как следствие, развития патологических состояний, так и создания генетических моделей заболеваний на основе лабораторных животных. Создание моделей митохондриопатий, приводящих к развитию оптической дистрофии, прогрессирующей энцефаломиопатии и периферической нейропатии, и мужского бесплодия на основе лабораторных животных позволит провести исследования механизмов развития патологий на уровне организма, а также заложить основу для разработки генно-терапевтических препаратов. Выявление генетических структур в результате биоинформатического анализа, а также применение генетических технологий для исследования роли РНК-модифицирующих ферментов в реализации генетической информации на уровне РНК в результате осуществления сплайсинга по альтернативным участкам позволит создать научный задел в целях идентификации новых мишеней направленной терапии социально-значимых заболеваний. Модели на основе лабораторных животных позволят выявить и описать механизмы развития патологий, возникающих в результате изменения программ сплайсинга, которые часто сопровождают, например, процессы опухолеобразования. Возникновение и закрепление антибиотикорезистентности бактерий становится все более угрожающей проблемой в современном мире. Неконтролируемое употребление антибиотиков приводит к появлению устойчивых штаммов болезнетворных бактерий, борьба с которыми представляет собой крайне актуальную задачу. В рамках настоящего проекта предстоит выявить новые генетические детерминанты, обусловливающие возникновение устойчивости бактерий к антибиотикам. Биоинформатический анализ позволит провести сопоставление генетических детерминант устойчивости к новому антибиотику с таковыми для известных антибиотиков. Полученные результаты будут использованы для выяснения генетических механизмов развития антибиотикорезистентности. В результате выполнения проекта будут получены несколько моделей заболеваний уже известной этиологии. Фундаментальные исследования позволят выявить новые генетические детерминанты, лежащие в основе перепрограмирования сплайсинга, определяющих развитие различных патологий. Направленная модификация выявленных генетических структур ляжет в основу создания новых моделей и изучения молекулярных механизмов патологических процессов. Предлагаемый подход позволит осуществлять эффективное использование генетических технологий для прорывных фундаментальных исследований механизмов функционирования клетки, создания моделей генетически-обусловленных заболеваний и создаст задел для создания новых генно-терапевтических препаратов.

Коллектив во главе с академиком О.А. Донцовой в течении более 30 лет исследует генетические основы функционирования РНК-белковых комплексов, таких, как рибосома и теломераза. В ходе предыдущих исследований коллективу удалось продемонстрировать кодирующий потенциал теломеразной РНК человека. 3’-концевой процессинг теломеразной РНК человека протекает в промотор-зависимой манере и требует участия белкового комлекса Интегратор. Коллектив имеет опыт изучения РНК метилтрансфераз бактерий и эукариот. Коллектив исполнителей имеет патент на способ выявления модифицированных нуклеотидов в РНК. Исполнители активно используют системы CRISPR/Cas9 для редактирования генома клеточных линий, благодаря чему определена функциональная роль неисследованных ранее генов Trmt2B, METTL15 и Mtln, а также продемонстрирована альтернативная функция теломеразной РНК человека. Коллектив имеет успешный опыт редактирования генома мышей и создания линий этих лабораторных животных с направленными изменениями генома. Коллектив исполнителей проекта имеет задел в исследовании митохондрий и, в частности, митохондриального белок синтезирующего аппарата. Для этого применяли методы изучения эффективности митохондриальной трансляции, а также методы выделения и изучения митохондриальных рибосом, включая аффинное выделение комплексов миторибосом. В ходе изучения функциональной активности рибосом E. coli и воздействия на них антибиотиков, была разработана удобная система тестирования эффективности терминации трансляции с использованием BODIPY-Met-тРНК. Все эти методы необходимо будет применить в данном проекте. Разработаны и валидированы методы предсказания консервативных комплементарных участков, в частности метод PREPH. Многие предсказанные структуры выявлены в экспериментах с использованием методов высокопроизводительного секвенирования. Коллектив имеет большой и успешный опыт поиска и изучения молекулярных механизмов действия новых антибиотиков-ингибиторов биосинтеза белка.

Выявлено 39 отличающихся белков тестикул и 20 отличающихся белков элонгированных сперматид между линиями мышей дикого типа и ΔNSUN7. Показано, что NSUN7 влияет на локализацию и элиминирование плектина из элонгированных сперматид. Не обнаружено отличий в уровне м5С РНК метилирования между образцами РНК мышей дикого типа и ΔNSUN7. Исследование физиологических проявлений нокаутирования генов Thumpd2 и Mettl4 показало, что для мышей Thumpd2-/- характерны патологические нарушения, наблюдаемые при диабете II типа, при этом мыши Mettl4-/- не проявляют такого же яркого патологического фенотипа, но у них так же зафиксированы серьезные метаболические нарушения. Анализ распределения генотипов в новых пометах мышей, несущих инактивирующие мутации в гене C12ORF65 в гетерозиготном состоянии, подтверждает эмбриональную летальность гомозиготных особей, показанную на предыдущем этапе проекта. Метилтрансферазы Mettl4 и Thumpd2 отвечают за внесение метильных групп по позициям m6Am30 в мяРНК U2 и m2G72 в мяРНК U6 соответственно. В результате анализа дифференциальной экспрессии и дифференциального сплайсинга в печени мышей нокаутных по генам указанных метилтрансфераз было показано, что исчезновение каждой из модификаций вызывает общее накопление несплайсированных интронов в РНК. Для ряда событий альтернативного сплайсинга смещение соотношения альтернативных изоформ было более заметно, при этом наибольшее количество статистически значимых изменений наблюдали для удержания интронов (IR). Описанный выше фенотип, вероятно, объясняется более медленной работой сплайсосомы, что ранее уже было показано на клетках HeLa S3. При этом накопление интронов в клетках печени, по-видимому, приводит к накоплению двухцепочечной РНК (из-за гибридизации смысловых и антисмысловых копий повторяющихся генетических элементов в интронах), что, в свою очередь, вызывает оверэкспрессию ряда генов, связанных с иммунным ответом на вирусы, содержащие двухцепочечную РНК. Клеточная локализация мяРНК U2 и U6 не зависит от статуса метилирования по позициям m6Am30 в мяРНК U2 и m2G72 в мяРНК U6. Показано влияние фактора SF3B1 на альтернативный сплайсинг пре-мРНК гена PHF20L1. Найдены регуляторные участки в гене андрогенового рецептора, предположительно образующие вторичную структуру РНК, которые влияют на альтернативный сплайсинг и/или полиаденилирование этого гена. Предсказаны 124 события альтернативного сплайсинга в 3’-нетранслируемых областях, активирующиеся при ингибировании системы NMD и имеющие потенциальные РСБ-регуляторы. Данные, полученные с помощью репортерной конструкции на основе двух люцифераз, указывают на то, что после трансляции кОРС DDX23 происходит реинициация трансляции на основной ОРС. В то же время, сдвиг рамки считывания в кОРС приводит к ее удлинению и пересечению с основной ОРС, что вызывает сильное падение эффективности трансляции основной ОРС DDX23. Последующее снижение уровня белка DDX23 негативно влияет на жизнеспособность клеточной линии человека HAP1. В ходе работы по изучению механизма действия антибиотика – боттромицина А2 – были получены следующие результаты. Применение эукариотической бесклеточной системы, полученной из клеток линии HEK293T, показало, что боттромицин А2, как и его менее активный гидролизованный аналог, отличающийся от боттромицина А2 отсутствием одной метильной группы, не влияет на процесс трансляции в клетках эукариот. Более детальное изучение механизма действия боттромицина А2 при помощи метода тоепринт-анализа показало, что эффективность действия боттромицина А2 зависит от нуклеотидной последовательности глицинового кодона и не зависит от кодона, располагающегося в P-сайте остановленной рибосомы. Также нам удалось выяснить, что боттромицин А2 ингибирует именно процесс переноса растущего пептида на Gly-тРНК, однако при этом, боттромицин А2 лишь частично блокирует продвижение рибосом по мРНК, создавая эффект «бутылочного горлышка» на глициновых кодонах и замедляя таким образом трансляцию.