ИСТИНА

1. В Проекте 2017 обнаружена способность белка Ku взаимодействовать с компонентами малого ядерного рибонуклеопротеинового комплекса 7SK: 7SK РНК и белком Cdk9, - которые являются важными участниками регуляции транскрипции, осуществляемой РНК-полимеразой II. Причем киназа Cdk9 в свободном состоянии является положительным фактором транскрипции, поскольку она фосфорилирует С-концевой домен РНК-полимеразы II и тем самым обеспечивает снятие элонгационного блока. В составе комплекса с 7SK РНК киназная активность Cdk9 ингибируется за счет его взаимодействия с белком HEXIM1, который является негативным регулятором транскрипции. В рамках Проекта 2020 мы планируем выяснить, может ли Ku, взаимодействуя с 7SK рибонуклеопротеиновым комплексом, влиять на степень фосфорилирования РНК-полимеразы II и таким образом регулировать транскрипцию. Этот результат в перспективе позволит выявить новые пути активации транскрипции с интегрированного провируса и выхода из провирусной латентности. 2. При выполнении Проекта 2017 мы показали, что Ku является положительным фактором регуляции транскрипции с промотора ВИЧ-1 как в составе репортерных векторов, так и интегрированного провируса. Однако мы не смогли детально охарактеризовать влияние Ku на транскрипцию при первичном акте заражения клетки с использованием лентивирусного вектора, поскольку мы установили, что Ku влияет на предшествующую транскрипции стадию постинтеграционной репарации. В рамках Проекта 2020 мы собираемся оценить влияние Ku на транскрипцию при заражении клетки и для этого планируем получить клеточную линию, в которой можно будет проводить регулируемую во времени деградацию Ku. Получение этой линии представляет интерес не только с точки зрения изучения репликации ВИЧ-1, но и для детального исследования роли Ku в различных клеточных процессах. 3. В ходе выполнения Проекта 2017 был проведен анализ данных РНК-секвенирования полных транскриптомов клеточных линий на основе НЕК 293T с пониженным уровнем каждой из субъединиц Ku и получен список дифференциально экспрессируемых генов. В рамках Проекта 2020 мы планируем провести протеомный анализ клеток НЕК 293Т с нормальным и пониженным уровнем Ku, сравнить результаты протеомного и транскриптомного анализов для того, чтобы выявить участников процессов транскрипционной регуляции и репарации ДНК, экспрессия которых зависит от уровня белка Ku. Это исследование имеет особую ценность, поскольку оно позволит получить дополнительную информацию о функциональной роли этого белка, который помимо транскрипции и репарации участвует еще в большом количестве клеточных процессов, включая поддержание длины теломер, апоптоз, V(D)J рекомбинацию.

1. In the framework of Project 2017 we have discovered a capacity of Ku protein to interact with the components of the small nuclear ribonucleoprotein complex 7SK: 7SK RNA and Cdk9 protein that are important participants in the regulation of transcription mediated by RNA polymerase II. Of note, Cdk9 kinase in the free state is a positive transcription factor, since it phosphorylates the C-terminal domain of RNA polymerase II thus providing removal of the elongation block. When Cdk9 is in complex with 7SK RNA, its kinase activity is inhibited due to its interaction with HEXIM1 protein, which is a negative transcription regulator. As part of Project 2020, we plan to find out whether Ku, interacting with the 7SK ribonucleoprotein complex, can alter the level of phosphorylation of RNA polymerase II thus regulating the transcription efficiency. This result in the long term will allow revealing new ways of activation of transcription from the integrated provirus and exit from proviral latency. 2. In the Project 2017, we have shown that Ku is a positive factor in the regulation of transcription from the HIV-1 promoter situated both in reporter vectors and integrated provirus. However, we have not been able to characterize in detail the effect of Ku on transcription in the primary act of cell infection using the lentiviral vector, because, as we found, Ku affects the pre-transcription stage of post-integration repair. In the framework of Project 2020, we are going to evaluate the effect of Ku on transcription during cell infection, and for this purpose we plan to prepare a cell line, in which time-regulated degradation of Ku can occur. Preparation of this cell line is of interest not only for the detail study of HIV-1 replication, but also for understanding the role of Ku in various cellular processes. 3. In the course of the Project 2017, RNA sequencing data of complete transcriptomes of HEK 293T cell lines with reduced levels of each of the Ku subunits have been analyzed and a list of differentially expressed genes has been obtained. Within the framework of Project 2020, we plan to perform proteomic analysis of HEK 293T cells with normal and reduced Ku levels, and compare the results of proteomic and transcriptomic analyses in order to identify participants of the processes of transcriptional regulation and DNA repair, expression of which depends on the Ku protein level. This work is particularly valuable since it can provide us with additional knowledge about functional role of this protein, which beyond transcription and repair is involved in a large number of cellular processes, including telomere length maintenance, apoptosis, V(D)J recombination.

1. Выяснение способности белка Ku регулировать транскрипцию за счет изменения уровня фосфорилирования С-концевого домена РНК-полимеразы II. – 2020 год 2. Отработка методики получения клеток, стабильно экспрессирующих белок osTIR1 и домен PB1 из ARF. Получение клеточной линии клеточной линии HEK 293-Ku70-AID-ARFpb1-osTIR. – 2020 год 3. Определение скорости деградации Ku70-AID в присутствии доксициклина и ауксина в полученной нами клеточной линии HEK 293-Ku70-AID-ARFpb1-osTIR. Полученный опыт в дальнейшем можно будет использовать для изучения программируемой деградации различных белков, содержащих домен AID. - 2021 4. Оценка влияния уровня белка Ku70 на транскрипцию с промотора ВИЧ-1 при трансдукции полученных клеточных линий псевдовирусом на основе лентивирусного вектора. – 2021 год 5. Определение генов, чья экспрессии изменяется на уровне мРНК и/или белка в ответ на подавленную экспрессию Ku70. Выявление участников процессов транскрипционной регуляции и репарации ДНК, экспрессия которых зависит от уровня белка Ku. - 2021 год В целом полученные результаты позволят не только выяснить механизм влияния белка человека Ku на транскрипцию с промотора ВИЧ-1 и в том числе на регуляцию провирусной латентности, но и получить важную информацию о компонентах клеточного ответа на изменение концентрации белка Ku и более детально охарактеризовать его участие в функционировании клетки.

Участники Проекта имеют большой опыт по изучению взаимодействия белка Ku с нуклеиновыми кислотами и белками, а также исследованию его роли в отдельных этапах репликации ВИЧ-1. В коллективе тщательно продуманы все подходы к решению поставленных задач. Все они основаны на использовании описанных методов, многие из которых уже были использованы участниками Проекта при решении различных задач. В группе успешно отработаны все технологии, которые будут применяться в данной работе, а именно: направленный нокдаун генов с помощью siРНК и shРНК, работа с лентивирусными векторами, технология CRISPR/Cas9 для осуществления нокаута генов, отбор клонов, Вестерн-блот анализ, идентификация белков методом масс-спектрометрии, протеомный анализ, исследование регуляции транскрипции с помощью репортерных конструкций и ПЦР, биоинформатический анализ больших баз данных. В коллективе имеются все репортерные и лентивирусные вектора, необходимые для выполнения работы, также получены клеточные линии HEK 293-Ku70-AID, НЕК 293-Ku70+/- и НЕК 293-Ku80+/-. Все это дает полную уверенность в том, что все запланированные результаты будут получены.