Разработка флуоресцентных сенсорных платформ на основе композитных материалов для определения биологически активных веществ в матрицах сложного составаНИР

Development of fluorescent sensor platforms based on composite materials for the determination of biologically active compounds in complex matrices

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 28 мая 2020 г.-31 декабря 2020 г. Разработка флуоресцентных сенсорных платформ на основе композитных материалов для определения биологически активных веществ в матрицах сложного состава
Результаты этапа: Для создания композитных сенсорных платформ нами получены новые универсальные полимерные матрицы на основе природных полимеров, служащие одновременно основой сенсора, сорбционным материалом для удерживания на его поверхности наночастиц серебра и флуоресцентного индикатора, а также сорбентом для извлечения и направленного транспорта аналитов. Предлагаемый нами подход апробирован на важнейших для контроля жизнедеятельности человека молекулах-маркеров различных заболеваний – биогенных аминах (БА). Применение металлов для определения биогенных аминов и их метаболитов можно разделить на два направления: металл-сенсибилизированную и металл-усиленную флуоресценцию, оба этих подхода комбинированно были использованы в первом этапе работы для разработки высокочувствительной сенсорной платформы для определения указанных аналитов. Металл-сенсибилизированная система для определения биогенных аминов основана на формировании тройного комплекса аналита с ионами европия(III) и окситетрациклином (Eu3+–ОТЦ) в мицеллярной среде неионогенного поверхностно-активного вещества Твин 80. Благодаря присутствию в растворе мицеллообразующего ПАВ, экранирущего флуорофор от молекул воды, увеличивалась интенсивность флуоресценции за счёт заключения комплекса Eu3+–ОТЦ–БА в мицеллы. Показано, что увеличение квантового выхода флуоресценции тройного комплекса Eu3+–ОТЦ–БА возможно осуществлять с помощью стабилизации (повышения «жесткости» структуры) комплекса и уменьшения количества молекул воды в его координационной сфере. Для решения этой задачи разработаны различные способы формирования 2D- и 3D-форм природных полимеров (пленочные структуры, гели) методами накапывания, спин-коатинга, трафаретной и струйной печати на поверхности стандартных предметных оптических (кварцевых) стекол и в многолуночных планшетах. При этом было показано, что наиболее интенсивный и воспроизводимый сигнал с минимальным фоном в видимой области спектра формируется в 3D-гелевых композитных структурах на основе альгината и коллагена, полученных простым методом накапывания и зафиксированных в лунках планшета для иммунохимического анализа. Последнее обеспечивает возможность одновременного анализа несколько десятков образцов с использованием серийного оборудования. Подобраны условия формирования тройного комплекса Eu3+-ОТЦ-БА в альгинатном гидрогеле и разработаны методики определения трех биогенных аминов (допамина, адреналина и гомованилиновой кислоты) на уровне их пикомолярных концентраций. Использование данной флуоресцентной твердофазной системы возможно для определения БА в биологических жидкостях (моче, плазме крови), но невозможно при работе с живыми клеточными культурами ex и in vivo из-за токсичного влияния ряда компонентов индикаторной реакции – европия(III) и ОТЦ. Для преодоления этой трудности разработана композитная структура - гелевая сэндвич-система, где токсичные для клеток компоненты индикаторной системы молекулы ОТЦ и катионы Eu3+ находятся в уже изученной нами альгинатной фазе, а биообъекты, в том числе клеточные структуры, выделяющие БА, в отдельной фазе – коллагеновой. Выбор второй фазы обусловлен тем, что для роста и развития клеточных культур лучше всего подходят 3D–гелевые структуры на основе белков, и коллаген наиболее изучен для решения поставленной задачи. Металл-усиленная флуоресценция. Начаты исследования по управлению спектральным диапазоном поверхностного плазмонного резонанса (ППР) путем целенаправленного изменения размера наночастиц золота/серебра, формы, агрегатов на их основе и, как следствие, спектральными свойствами поверхности в целях обеспечения совпадения спектров поглощения наноструктурированной поверхности и длины волны возбуждения или самой молекулы-аналита, или индикаторного вещества для реализации эффекта ППР. Спектры возбуждения флуоресценции показали, что оптимальной длиной возбуждения флуоресценции тройного комплекса с наночастицами серебра является 404 нм (без наночастиц серебра λex = 415 нм), а длина волны испускания флуоресценции осталась прежней - 617 нм. Так как коэффициент усиления флуоресценции (согласно литературным данным) сильно зависит от природы, формы, размера, дисперсии и окружения наночастиц, нами были опробованы разные методы синтеза серебряных НЧ. В качестве оптимального выбран цитратный способ их получения. Спектр НЧ имел только один пик на 400 нм, что согласно табличным данным соответствует наночастицам серебра размером 15-25 нм. Использование наночастиц серебра AgNPs разных концентраций дает усиление флуоресценции в 2.5–3 раза для данной системы. На примере дофамина было показано что наилучшее относительное усиление в присутствии 1 пМ дофамина получено при концентрации цитратных AgNPs, эквивалентной 60 мкМ серебра. Таким образом, продемонстрировано, что применение металл-усиленной флуоресценции позволяет увеличить интенсивность эмиссии флуорофора и, как следствие, понизить пределы обнаружения аналитов. Разработка мультисенсорных платформ Создаваемые в проекте сенсорные системы предполагается объединять в платформы, состоящие из нескольких элементов, отклик каждого из которых на разные компоненты системы различен. Для этого выбирают модельные системы, включающие флуорофоры и аналиты, позволяющие, с одной стороны, дискриминировать образцы сложного состава флуоримет¬рическим методом «отпечатков пальцев», а с другой стороны – определять в таких образцах аналиты количественно. Для получения максимальных спектральных различий выбирали флуорофоры, взаимодействующие с низкомолекулярными органическими соединениями по различным механизмам. Предварительно выбирали также неспецифические флуорофоры, позволяющие учесть матричные эффекты. В качестве такого флуорофора рассмотрели флуоресцеин (Фл). Установили, что эмиссия Фл тушится в присутствии биологической матрицы (гомогената мышц индейки), что позволяет использовать этот краситель как неспецифический флуорофор для коррекции полезных сигналов в визуализаторе при возбуждении при 254 нм. Показали, что для одновременного определения двух и более компонентов может быть использована смесь флуорофоров: карбоцианина и третбутилфталоцинина алюминия. Эмиссия первого из названных флуорофоров тушится тетрациклинами, цефалоспоринами, сульфаниламидами, изониазидом, хлорамфениколом и метамизолом, тогда как второй флуорофор дает сигнал с рядом анионов. Полученные результаты создают основу для разработки твердофазных сенсорных систем для одновременного определения нескольких компонентов в биоматрицах флуориметрическим методом. Оценка эффективности дискриминации образцов Стандартных методов хемометрики не всегда достаточно для решения текущих задач. При разработке методов «отпечатков пальцев» желательно располагать критериями выбора флуорофоров, которые позволили бы разделять классифицируемые объекты на наибольшее число групп. Задача усложняется в том случае, когда на графиках счетов разделены не все образцы. Мы предложили простой способ оценки эффективности дискриминирования путем подсчета числа пересечений доверительных эллипсов на графике счетов (уровень значимости 82%). Два эллипса могут пересекаться в двух, трех или четырех точках; случай, когда один эллипс лежал внутри другого, принимали за 4 пересечения. Подсчитывали общее число пересечений ЧисП всех эллипсов на данном графике счетов, что и служило критерием эффективности дискриминирования в использованных условиях. Для сравнения предложенного параметра со стандартными рассчитывали стандартный параметр "общая чувствительность". (Этот показатель служит мерой эффективности классификации, являясь отношением правильно классифицированных образцов к числу всех образцов.) Для расчета ОЧ необходима информация о правильно и неправильно отнесенных образцах (что не требуется при использовании предлагаемого нами критерия ЧисП). Значения ОЧ, основанные на расчете расстояния Махаланобиса между классами, а также ЧисП и числа разделенных групп рассчитаны для 36 образцов меда. Оказалось, что параметр ЧисП в определенной степени сходен с параметром ОЧ (коэффициент кореляции 0.79). Предложенный параетр позволил выбрать наиболее эффективный флуорофор: (Ru(bpy)3)2+ занимает лидирующие позиции среди других флуорофоров и по параметру ЧисП (112), и по числу разделенных групп, и по значениям общей чувствительности ОЧ. Таким образом, параметр ЧисП показал свою эффективность при оценке качества дискриминирования на примере образцов меда. Он не требует выделения проверочного набора данных и может быть рассчитан без использования программного обеспечения, если построены доверительные эллипсы и может быть использован как независимая характеристика качества дискриминирования образцов в различных (не только флуориметрических) методах "отпечатков пальцев" (этот подход описан нами в Sensors, 2020, 20(18), 5351; https://doi.org/10.3390/s20185351).
2 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. Разработка флуоресцентных сенсорных платформ на основе композитных материалов для определения биологически активных веществ в матрицах сложного состава
Результаты этапа: Разработаны способы включения наночастиц золота и серебра в полимерные структуры, позволяющие получить наноструктурированные флуоресцентные платформы. За счет целенаправленного изменения размера и формы наночастиц и агрегатов на их основе усовершенствованы способы управления спектральным диапазоном поверхностного плазмонного резонанса (ППР), за счет чего обеспечено совпадение спектров поглощения наноструктурированной поверхности и длины волны возбуждения аналита или индикаторного вещества для реализации эффекта ППР. Проведена функционализация поверхности «распознающими» молекулами или получение таковых в результате фотокаталитических реакций, что позволило селективно получить поглощающие в видимой области индикаторные соединения, способные вступать в поверхностный плазмонный резонанс с наночастицами благородных металлов. Проведено компьютерное моделирование свойств полученных материалов и регистрируемого аналитического сигнала. Предложены твердофазные флуоресцентные индикаторные системы для высокочувствительного и селективного определения низкомолекулярных биологически активных соединений (фенольные соединения, амины различного строения, хиноны, пероксиды) и диагностические белки и ферменты (гемоглобин, цитохром С, пероксидаза, каталаза). Найдены пути управления физико-химическими характеристиками композитных полимерных сенсорных материалов под различные группы аналитов и исследуемых объектов в результате модифицирования селективными био- и хемираспознающими индикаторами и фотокатализаторами. Выбран полимерный носитель и иммобилизованы компоненты предложенной на первом году мультисенсорной системы в пленке носителя и выбраны условия проведения определения с формированием аналитического сигнала в пленке. Показана возможность определения модельного аналита (лекарственного вещества) с помощью комбинации флуорофоров, добавляемой к матрице сложного состава (гомогенат мыщц индейки, биологическая жидкость). Реализован метод расчета содержания аналита, показаны лучшие по правильности результаты определения предлагаемым методом по сравнению с методом добавления только одного флуорофора. Найдена комбинация флуорофоров, отклик каждого из которых на разные аналиты различен. Проведено одновременное определение двух аналитов сложных биообъектах с помощью добавки такой комбинации.
3 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. Разработка флуоресцентных сенсорных платформ на основе композитных материалов для определения биологически активных веществ в матрицах сложного состава
Результаты этапа: I. Оптические сенсорные системы, иммобилизованные в полимерные пленки и гели Сенсоры на основе эффекта поверхностного плазмонного резонанса На основании результатов, полученных на 1-м и 2-м году проекта, предложено совместить преимущества использования полимерного субстрата – хитозана – и добавки на основе двумерного материала оксида графена (ОГ) для создания новой высокоэффективной плазмонной платформы. Разработана простая масштабируемая методика получения сенсора на основе эффекта поверхностного плазмонного резонанса (ППР-сенсора) на основе свободно стоящей хитозановой пленки, наночастиц серебра (НЧС) и оксида графена. Хитозан позволил равномерно распределить НЧС из коллоида и получить воспроизводимый сигнал комбинационного рассеяния. Добавка на основе оксида графена в коллоидный раствор НЧС позволила после высаживания композита на хитозан снизить флуоресцентный фон от аналита. Высокая диспергируемость ОГ в воде и использование водного коллоида НЧС позволили упростить методику создания сенсора благодаря нанесению композита «ОГ-серебро» на хитозановую пленку без дополнительной стадии нанесения пленки ОГ в качестве подслоя. Изучен ряд ключевых аналитических характеристик полученных плазмонных гибридных структур: чувствительность, воспроизводимость от сенсора к сенсору, стабильность и тушение флуоресцентного фона на примере флуорофора – родамина 6Ж. Микроструктура образцов сенсорных поверхностей исследована с помощью автоэлектронной эмиссии сканирующих электронных микроскопов (СЭМ, Carl Zeiss NVision 40 и LeoSupra 50 VP) при ускоряющем напряжении 3 кВ. Исследования методом спектроскопии комбинационного рассеяния (КР) проводили с помощью спектрометра Enspectr с использованием твердотельного лазера (длина волны – 532 нм, 50 мВт). Мощность лазера составляла 1%, время накопления 1 с, 10× объектив, 10 накоплений. Из фотографий СЭМ с разными увеличениями видно, что на хитозановой пленке НЧС распределены равномерно. Средний размер частиц составил 37±7 нм. Хитозановая пленка с НЧС поглощает в области 430 нм, что согласуется с плазмонным пиком коллоида. Из спектра поглощения в УФ-видимой области был рассчитан средний размер НЧС, который составил 35 нм. Данные микроскопии согласуются с данными спектрофотометрии. Параметры синтеза композита устанавливали согласно его плазмонной активности. Последнюю проверяли на модельном красителе родамине 6Ж. В спектре поверхностно-усиленного КР родамина 6Ж присутствуют интенсивные характеристические пики: при 604 и 761 см–1, которые соответствуют деформациям ксантенового кольца; 1362 см–1 соотносится с колебанием связи С–Н метильной группы; пики при 1172, 1510, 1572 и 1648 см–1 с большой интенсивностью относятся к растяжениям бензольного кольца. Установлено, что эффективность выдерживания хитозановых пленок в серебряном коллоиде с ультразвуковой (УЗ) обработкой существенно эффективнее, чем без нее (рис. 2d). Коэффициент усиления (КУ) для композита, полученного при УЗ обработке, вдвое выше, чем без нее. Максимальной величиной КУ обладает подложка, изготовленная из 1% раствора хитозана, пики модельного соединения на ней наиболее интенсивные и имеют лучшее соотношение сигнал/шум. Изучили влияние добавки ОГ на сорбцию наночастиц на полимерном субстрате и плазмонную активность сенсорной поверхности. Подготовлены пять коллоидных растворов НЧС Леопольда-Лендла и наночастиц с добавкой ОГ с массовым соотношением Ag:ОГ равным 1000:1, 100:1, 10:1, 1:1. Методом спектрофотометрии найдено, что на хитозановую пленку (5×5 мм) сорбируется в среднем 0.035 мкМ серебра. C увеличением количества ОГ в коллоиде сорбция уменьшается. Это может быть связано с конкурентной сорбцией ОГ на хитозане и как следствие, уменьшением сорбции серебра на его поверхности. Полученные сенсорные поверхности сравнивали по интенсивности пика при 609 см-1. Увеличение добавки оксида графена привело к тушению фона флуоресценции родамина 6Ж в области от 200 до 800 см-1 и к значительному улучшению соотношения сигнал/шум. Показано, что плазмонная структура позволяет получить воспроизводимый сигнал на большой площади поверхности (десятки мкм). Проведена оценка воспроизводимости сигнала – подготовлено десять плазмонных сенсорных поверхностей, синтезированных в одинаковых условиях. Для каждого сенсора получены поверхностно-усиленные спектры родамина 6Ж (условия съемки оставались постоянными). Воспроизводимость сигнала от сенсора к сенсору оценивали по изменению КУ от подложки к подложке. Почти на всех сенсорах коэффициент усиления (КУ) в среднем составил 1·105 и был хорошо воспроизводим. Добавление оксида графена (ОГ) в коллоидный раствор НЧС подавляет фоновый сигнал флуоресценции от аналита и приводит к увеличению отношения интенсивности сигнала к фоновой интенсивности флуоресценции до 6 раз по сравнению со структурами без ОГ. Плазмонный полимерный нанокомпозит обеспечивает предел обнаружения до 100 пМ родамина 6Ж для длины волны лазера 532 нм (портативный объектив×10). Высокая коллоидная стабильность ОГ в воде и использование водного коллоида НЧС упрощают методику синтеза подложки путем нанесения композита ОГ-серебро на поверхность пленки хитозана без необходимости формирования пленки ОГ. Таким образом, предложенный подход открывает многообещающие возможности для обеспечения более чувствительного обнаружения в том числе флуоресцентных аналитов с помощью коротковолновых лазеров (532, 633 нм) вместо ИК (785, 1024 нм) и способствует практическому применению разработанных плазмонных композитов в портативных спектрометрах комбинационного рассеяния. Описанная ППР сенсорная поверхность перспективна для определения низко- и высокомолекулярных маркеров нейромедиаторного обмена (катехоламинов и их метаболитов, диагностических белков), позволяет расширить круг объектов, анализировать различные объекты ex vivo и in vivo с минимальной пробоподготовкой или без нее за счет снижения матричных эффектов. В этом году мы предложили новый подход к молекулярной иммобилизации и резонансному комбинационному усилению соединений с помощью комплексов-усилителей (Molecular Immobilization and Resonant Raman Amplification by Complex-Loaded Enhancers, MIRRACLE) на покрытых хитозаном плазмонных металлических наноструктурированных субстратах и продемонстрировали перспективность его применения на ряде маркеров нейромедиаторного обмена. Этот подход апробирован на модифицированных медь(II)-хитозан-модифицированных плазмонных металлических наноструктурированных субстратах для чувствительного и быстрого определения катехоламинов (КА): дофамина, адреналина и норадреналина. Тройные комплексы (КA)2Cu(4AAП)2 характеризовались появлением новых полос поглощения при 555, 600 и 500 нм для дофамина, норадреналина и адреналина соответственно (4ААП – 4-аминоантипирин). Новая полоса поглощения соответствует широкой полосе поверхностного плазмонного резонанса используемых НЧС: 450–600 нм и длина волны возбуждения 633 нм. За счет дополнительного резонансного усиления коэффициенты усиления составили 3,6·10^6. Возможности мультиплексирования количественного спектрального разделения для спектров комбинационного рассеяния группы КА, которые отличаются только гидроксильной или метильной группой, в области отпечатков пальцев были успешно продемонстрированы с помощью классической модели наименьших квадратов. Достигнутые пределы обнаружения на уровне нмолярных концентраций при мощности лазера всего 1,5 мВт позволили успешно апробировать разработанную сенсорную систему для определения катехоламинов на уровне референсных концентраций в крови здоровых людей. Также предложен подход без использования различных меток для прямого воспроизводимого и высокочувствительного определения макромолекулярных соединений. В качестве таких аналитов выбраны амилоид-β (Aβ) и его агрегаты. Исследованы агрегаты мономерных пептидов и амилоида-β, индуцированные ионами Zn(II) и Cu(II), методами ПЭМ, вестерн-блоттинга и поверхностно-усиленной спектроскопии комбинационного рассеяния. Впервые две высокоэффективные плазмонные наноструктуры успешно использованы для того, чтобы различить агрегаты Aβ42 и мономеры, при высокой чувствительности определения потенциально цитотоксичных олигомеров Aβ42. Первая плазмонная платформа, описанная выше, состояла из НЧС/хитозан (AgNP/CS)53 – пленок хитозана, декорированная сферическими НЧС. Пленка хитозана обеспечивала равномерное распределение НЧС по всей плазмонной области полимерной подложки, поэтому стабильный рамановский сигнал Aβ и его агрегатов мог быть обнаружен с помощью портативного 532-нм лазера. Для второй подложки мы использовали другой подход, основанный на лазерно-индуцированном осаждении (LID). LID приводит к образованию равномерно распределенной плотной популяции НЧС (AgNP/LID). Датчик AgNP/LID позволяет получать высокочувствительные и воспроизводимые сигналы комбинационного рассеяния. Плазмонные субстраты, синтезированные с помощью LID, адаптированы для определения макромолекулярных объемных объектов, таких как Aβ, с использованием лазера с меньшей энергией 633 нм. Первая ППР-сенсорная система на основе хитозановой пленки и НЧС позволила надежно определить количество агрегатов Aβ с пределом обнаружения 1,5 нМ с использованием портативного спектрометра комбинационного рассеяния с лазером 532 нм. Вторая сенсорная структура, полученная методом лазерно-индуцированного осаждения (AgNP/LID), обеспечивают высокую чувствительность определения агрегатов Aβ при концентрациях до 15 пМ (в пересчете на пептидный мономер). Более плотная популяция горячих точек и LSPR с красным смещением привели к снижению предела обнаружения на два порядка при использовании лазера с меньшей энергией (633 нм). Таким образом, AgNP/LID в сочетании с лазером с длиной волны 633 нм открывает возможность продолжения фундаментальных исследований агрегации β-амилоида и образования бляшек: конформации, условий, стабильности, кинетики и т. д., где необходимо разрешение мод. В то же время, плазмонную композитную поверхность на основе хитозана и НЧС можно применять для анализа биологических образцов на месте оказания медицинской помощи. Генерация пероксида водорода из наночастиц пероксида цинка Успешно продолжены исследования по in situ генерации пероксида водорода «по требованию» из наночастиц ZnO2 путем регулирования pH буферным раствором в сенсорных системах на основе пероксидазы из корней хрена. Благодаря этому подходу исключается необходимость добавления основного субстрата извне, что позволяет перейти к безреагентным оптическим сенсорам с участием указанного фермента. Разработаны оптические сенсорные элементы на основе пероксидазы, хромогенных субстратов-восстановителей (3,3',5,5'-тетраметилбензидина – ТМБ и 2,2′-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфокислоты – АБТС), флуорогенного субстрата (о фенилендиамина) и наночастиц ZnO2, иммобилизованных в полимерные матрицы природных полимеров (хитозана и альгината кальция). По предварительным результатам, сенсорные элементы сохраняют стабильность при хранении не менее трёх месяцев. На основе оптического сенсорного элемента хитозан- наночастицы ZnO2 – ТМБ или АБТС разработаны спектрофотометрические методики определения активности пероксидазы в интервале 90-485 ед./мг. Предложенный сенсорный элемент апробирован при определении активности пероксидазы в венозной крови человека методом «введено-найдено». Разработаны методики определения витаминов группы P (эпикатехина, кверцетина) и витамина В1 (тиамина) на уровне микромолярных и наномолярных концентраций, соответственно, c использованием спектрофотометрического и флуоресцентного сенсорных элементов пероксидаза-ZnO2. На примере эпикатехина и кверцетина продемонстрирована возможность суммарного определения витаминов группы Р в различных объектах. Методика флуоресцентного определения витамина В1 была апробирована в анализе венозной крови после гемолиза. Индикаторные системы на основе карбоцианиновых красителей При создании простых и экспрессных оптических способов определения органических аналитов, на основе которых можно было бы разрабатывать тест-методики, актуален поиск новых индикаторных систем. В качестве аналитических реагентов широко используют карбоцианины – красители, интенсивно окрашенные и флуоресцирующие в ближней ИК (БИК) области спектра. Реакционноспособные карбоцианины способны замещать атомы галогена на нуклеофил, например, серосодержащее соединение, что приводит к изменениям в их спектрах поглощения и флуоресценции. В качестве серосодержащих аналитов в литературе использовали сульфид-ион, цистеин и глутатион, но нет сообщений о взаимодействии с крупными серосодержащими молекулами, такими как цефалоспориновые антибиотики. Мы обнаружили, что коммерческий карбоцианиновый краситель IR-783 в слабощелочном растворе взаимодействует с цефалоспоринами, приводя к контрастному изменению окраски (краситель сине-зеленый, продукт малиновый, табл/ 1). Таблица 1. Длины волн максимумов поглощения и флуоресценции красителя IR-783 в присутствии ПАВ и цефалоспоринового антибиотика Система Длина волны, нм поглощения эмиссии (возб. при 430 нм) Краситель 783 510 и 800 Краситель + цефтриаксон 530 570 Краситель + ЦТАБ 440 515 Кроме того, для перехода от обычных методик «мокрой химии» к созданию тест-систем, не требующих применения растворов реагентов, мы поставили задачу выбора и использования подходящего полиэлектролитного носителя для всех компонентов индикаторной реакции. Поиск такого носителя для системы IR-783 – цефтриаксон привел нас к альгинату кальция, совместимому со всеми компонентами системы: красителем, щелочью и аналитом. Технически гель альгината формировали в 96-луночном планшете, что отвечало требованию простоты и позволяло воспроизводимо получать образцы геля. В ячейке планшета смешивали: 20 мкл 0.03 М КОН, 40 мкл 0.015 М альгината натрия, 25 мкл 0.2 мМ красителя и вводили 15 мкл 5%-го раствора хлорида кальция, что приводило к гелеобразованию. Впоследствии в такую ячейку добавляли 200 мкл анализируемого раствора, содержащего цефалоспорин. Реакция протекала в течение получаса при нагревании на водяной бане при 80С, после чего планшет фотографировали и выполняли RGB-разложение изображений лунок. В качестве аналитического сигнала использовали интенсивность канала G. С помощью такой системы показали возможность определения цефтриаксона в водном растворе в диапазоне 1·10–5–1.3·10–4 М со стандартным отклонением 7%. Любопытны результаты сравнения селективности определения цефтриаксона в отсутствие и в присутствии геля альгината кальция. Ионы Na+ и K+ не мешали определению, Ca2+ и Mg2+ мешали только в растворе (в варианте без геля), то есть переход к определению с помощью геля позволил устранить мешающее влияние некоторых двухзарядных катионов. При изучении вышеописанной системы был отмечен очень значительный сдвиг максимума поглощения красителя IR-783 в присутствии бромида цетилтриметиламмония (ЦТАБ) – почти 350 нм. Эти спектральные изменения были положены в основу методики определения ЦТАБ в водном растворе в диапазоне 3–25 мкМ с пределом обнаружения по 3s-критерию 1.6 мкМ и sr = 0.02–0.05. Другие катионные ПАВ также дают подобный сигнал, однако чувствительность к различным ПАВ разная. Методика может быть применена к объектам, не содержащим других катионных и анионных ПАВ, кроме ЦТАБ. В качестве такого объекта проанализировали лизирующий буфер «ДНК-сорбЦ-ОД» для выделения ДНК из биологического материала, содержащий ЦТАБ (ООО «ОД-ТЕСТ»). Методика опубликована в журнале «Аналитика и контроль» (2022, т. 26, № 3, с. 204–211. DOI: 10.15826/analitika.2022.26.3.004). Приведенные результаты свидетельствуют о перспективности разработки оптических индикаторных реакций на основе реакционноспособных карбоцианинов для определения низкомолекулярных органических аналитов оптическими методами. Основанные на таких реакциях тест-системы целесообразно разрабатывать, например, на основе геля альгината кальция. Следует подробнее исследовать возможности повышения селективности определения за счет перехода к гелевым тест-системам. II. Оптические сенсорные системы с использованием индикаторных реакций Проведенный нами поиск эффективных оптических индикаторных систем выявил возможность предложить и реализовать новый подход в области оптических методов «отпечатков пальцев». Методы «отпечатков пальцев» – это методы качественного анализа, позволяющие различать объекты близкого состава и проводить их кластеризацию, дискриминацию и аутентификацию. В количественном варианте методы «отпечатков пальцев» позволяют определять содержание аналитов в смесях. Оптические варианты методов «отпечатков пальцев», как правило, используют собственные спектры (поглощения, эмиссии и т.д.) образцов. Увеличить информативность этих методов можно, вводя добавки веществ, взаимодействующих с компонентами объекта, например, добавляя флуорофор, в таком случае сигнал собственных флуорофоров образца складывается со спектром добавки, зависящим от присутствия и концентрации других (нефлуоресцирующих) компонентов образца (Miranda et. al, J. Am. Chem. Soc., 2007, 129, 9856–9857; Divyanin, Beklemishev, Microchem. J., 2017, 135, 48–54). Это второе поколение метода отпечатков пальцев. Третьим поколением метода стало предложенное нами в рамках настоящего проекта проведение индикаторной реакции в присутствии образца; в этом случае все спектральные характеристики измеряются не однократно, а во времени (Журн. аналит. химии, 2021, 76, 1089). В литературе удается найти единичные работы со сходной идеологией (использование кинетического фактора в сочетании с обработкой данных методами хемометрики): Pargari e.a., J. Anal. Chem., 2022, 77, 482–492; Lin Xin e.a., J. Coll. Interf. Sci., 2021, 602, 513–519). Исследование возможностей метода «отпечатков пальцев» в предлагаемом нами варианте включало изучение отношения индикаторных реакций к стандартному набору 30 водорастворимых модельных аналитов (в основном, лекарственных веществ) – чем сильнее различались отклики, тем более перспективной считали индикаторную систему; далее проводили распознавание модельных соединений сходной природы (например, сульфаниламидов) и затем переходили к дискриминации реальных объектов. Определение величины дозы, поглощенной клубнями картофеля Облучение продлевает срок хранения продуктов, минимизируя количество микроорганизмов, стимулирует прорастание семян и др. Закон о радиационной обработке продуктов питания скоро будет принят и в России. Дозы облучения продуктов подлежат строгому контролю, так как передозировка может привести к неблагоприятным последствиям для здоровья человека. Обычно дозу облучения определяют дозиметром, который облучают одновременно с продуктом. Однако недобросовестные производители могут скрыть факт превышения дозы или даже сам факт лучевой обработки продуктов. Следовательно, регулирующие органы должны располагать методикой определения дозы после окончания облучения. В литературе не удается найти примеров постановки и решения такой задачи. Для определения дозы после облучения мы предложили воспользоваться методом «отпечатков пальцев». В качестве продукта выбрали клубни картофеля, облучение которых требуется для продления срока хранения или стимулирования прорастания. Цель работы заключалась в разработке методики, позволяющей отличить облученные клубни, обработанные ускоренными электронами или рентгеновским излучением, от необлученных, и оценить порядок поглощенной дозы (например, 10000, 1000, 100, 10 или 0 Гр). После облучения с получением известной дозы клубни очищали, снимали верхний слой клубней (в пределах 1 мм) и получали их водный экстракт. Попытка использовать для определения дозы классический метод «отпечатков пальцев» была безуспешной: интенсивность собственной флуоресценции картофеля не менялась после облучения. Не увенчалась успехом и попытка введения добавок флуорофоров к образцам картофеля: сигнал добавленного красителя не менялся с величиной дозы. Обратились к третьему поколению метода отпечатков пальцев, основанном на проведении индикаторных реакций следующих двух типов: (1) каталитического окисления красителей пероксидом водорода и (2) образования флуоресцентных агрегатов аналитов с красителем и ПАВ. Предполагалось, что аналиты (вещества, отвечающие за сигнал) могут связываться с ионом переходного металла (Cu2+ или Pd2+), катализирующим окисление красителя. Как следствие, должна изменяться скорость реакции окисления, что можно наблюдать по поглощению видимого света и изменению интенсивности флуоресценции красителя. Результаты показали, что клубни, облученные электронным пучком, могут быть отнесены к одной из доз (10000, 1000, 100, 10 или 0 Гр) со 100%-ной правильностью для клубней одного сорта. Показали также возможность различения доз рентгеновского излучения, поглощенных образцами картофеля, с правильностью, равной 95%. Таким образом, дозу можно определять независимо от типа излучения: электронного пучка или рентгеновского излучения. В дальнейшем потребуется изучить возможность определения дозы, поглощаемой другими продуктами питания, для чего необходимо будет выбрать методы получения экстрактов продуктов и подходящие индикаторные реакции. Еще одним важным направлением исследований будет изучение влияния времени хранения образцов, чтобы выяснить, через какое время после облучения еще можно определить дозу (например, если образец был облучен неделю назад). Ограничения предлагаемого метода «отпечатков пальцев» – необходимость анализа эталонных образцов, получивших известную дозу, наряду с неизвестными, а также необходимость выбора индикаторной реакции при переходе к новому продукту. Преимущество предлагаемого метода по сравнению с методиками хроматографии (заметим, что хроматографических методов определения дозы после окончания облучения пока не разработано) заключается в его относительной простоте и отсутствии необходимости в использовании спектрального или другого сложного оборудования. Таким образом, предложенный усовершенствованный вариант методов «отпечатков пальцев» оказался мощным способом дифференциации смесей близкого состава.
4 15 мая 2023 г.-31 декабря 2023 г. Разработка флуоресцентных сенсорных платформ на основе композитных материалов для определения биологически активных веществ в матрицах сложного состава
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".