Направленная дифференцировка клеток млекопитающих в системе in vitro.НИР

Directional differentiation of mammalian cells in vitro

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. Направленная дифференцировка клеток млекопитающих в системе in vitro.
Результаты этапа: Показано, что мелатонин активирует в клетках человека линии ARPE-19 (клетки пигментного эпителия глаза) начальные этапы пронейральной дифференцировки: стимулирует увеличение размеров клеток (на 25%) за первые сутки культивирования, снижает пролиферацию клеток от 15.5% до 40% (МТТ-тест), снижает экспрессию РПЭ- маркеров и в течение 24-48 ч. повышает уровнь экспрессии маркеров нейральной дифференцировки Nestin и TubB3 (Метод ПЦР в реальном времени). При исследовании регуляторных свойств везикулярного компонента паракринной секреции клеток проведен выбор референсных генов и прослежено содержание маркеров плюрипотентности (Oct4, Sox2 и Nanog), маркеров ранней нейральной дифференцировки (Pax6, Nestin), маркеров нейронов (TubB3, MAP2) и астроцитов (S100B), а также содержания микроРНК в клетках и их везикулах в ходе нейральной дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клетках (ИПСК) человека. Показано, что на 35 сутки дифференцировки in vitro в нейральных производных ИПСК сохраняется экспрессия Oct4, Sox2 и Nanog и выявляется экспрессия Pax6, Nestin, TubB3, MAP2 и S100B, а в их везикулах, выявлены мРНК генов-маркеров только нейральной дифференцировки и Sox-2. Как в ИПСК и в их нейральных производных (НП-ИПСК), так и во внеклеточных везикулах обоих типов клеток выявлены микроРНК-151 и -486. Везикулы от ИПСК, так и от НП-ИПСК вызывают некоторое усиление пролиферации ИПСК в культуре, но не влияют на уровень экспрессии маркеров плюрипотентности.Проведены пилотные эксперименты по исследованию стволовых клеток и их везикул методом ToF-SIMS. При анализе генетических изменений в процессе получения половых клетки человека in vitro из ИПСК посредством мейотической индукции, был выполнен транскриптомный анализ (RNAseq) ИПСК, ППК-подобных и мейоцитоподобных клеток человека. Биоинформационный анализ совокупности всех РНК-транскриптов продемонстрировал соответствие изменений в ряду ИПСК – ППК-подобные – мейоцит-подобные клетки согласно генной онтологии изменениям при дифференцировке ППК в мейотические клетки in vivo. В рамках работы по оптимизации тканевой модели живого эквивалента кожи in vitro для регенеративной биомедицины проследили динамику изменений клеток в культуре кератиноцитов человека после криохранения в суспензии. Методами иммуноцитохимии, ПЦР в реальном времени, вестерн-блоттинга и проточной цитометрии показали, что к 7-му дню культивирования после криохранения восстанавливаются основные показатели популяции (уровень содержания маркерного белка p63; уровень экспрессии гена, кодирующего α6-интегрин, скорость колонеобразования), а также способность кератиноцитов образовывать эпидермальный эквивалент кожи становится сопоставимой с таковой в кератиноцитах до криохранения - они могут формировать 1-2 клеточных слоя на синтетическом коллагеновом каркасе.
2 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. Направленная дифференцировка клеток млекопитающих в системе in vitro.
Результаты этапа: При изучении пронейральной дифференцировки клеток ретинального пигментного эпителия человека прослежена динамика изменения профиля экспрессии генов OCT4, NANOG, KLF4, PAX6, OTX2, MITF, NES, TUBB3, BMP2, BMP4, KRT18, CTNNB1, GSK3B, CCND1 в клетках культуры ARPE-19 под действием кондиционированной среды регенератов сетчаток тритонов. Показано, что изменения соответствуют состояниям эпителио-мезенхимного перехода и дифференцировке клеток по нейральному пути. При исследовании внеклеточных везикул (ВВ) клеток с индуцированной плюрипотентностью (ИПСК) и их нейральных производных (НП-ИПСК) прослежено изменение профиля микроРНК в клетках и в ВВ, коррелирующее с направлением процесса дифференцировки ИПСК – в частности, происходит снижение содержания микроРНК-302d-3p и микроРНК-302b-3p, характерных для состояние плюрипотентности, и появление микроРНК-99а-5р, характерной для нейральной дифференцировки. При изучении биологического действия внеклеточных везикул на модели культуры фибробластов линии HdFb(d75)GFP (характеризующихся длительным клеточным циклом) показано, что добавление к среде инкубации ВВ, секретируемых как от ИПСК, так и НП-ИПСК на продвинутых фазах дифференцировки, не влияет на пролиферативную активность, оцениваемую методом проточной цитофлюориметрии и иммуноцитохимии. Анализ (PCA) транскриптомных данных методом главных компонент подтверждена близость и схожесть клеток, получаемых нами при индукции мейоза в культивируемых плюрипотентных клетках, и клеток Yamashiro (2018),полученных в результате дифференцировки ППК-подобных клеток из ИПСК. Транскриптом клеток при индукции мейоза в ИПСК показал возрастающую экспрессию вовлеченных в процесс мейоза генов- SCP2/3, REC8, MSX1/2, MAEL и DUSP18. В период дифференцировки увеличивали экспрессию гены DAZAP2, LEF1 и KRBOX4. Гены ключевых сигнальных молекул BMP2/4/5/7 и RSPO1/Wnt4 активровались во время спецификации и развития ППК-подобных клеток, параллельно с повышеннием уровня транскриптов ключевых сигнальных рецепторов (BMPR2, BMPR1A, BMPR1B) и их мишеней (ID1, ID2, ID3, ID4, MSX1 / 2).
3 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. Направленная дифференцировка клеток млекопитающих в системе in vitro.
Результаты этапа: Были проанализированы и обобщены в свете собственных данных материалы по морфологическим и молекулярно-генетическим исследованиям гетерогенности клеток ретинального пигментного эпителия (РПЭ) у млекопитающих и человека, по механизмам репрограммирования не нейрональных клеток ЦНС (в т.ч. и РПЭ) в нейроны in vitro и in vivo. Анализ протеомных профилей внеклеточных везикул (ВВ) индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека(ИПСК-ч) и нейрональных производных(НП) этих клеток выявил около 1000 белков. Функциональная аннотация представленности белков, проведенная с использованием баз данных Reactom, GO CC, GO BP и KEGG продемонстрировала, что ВВ НП-ИПСК-ч содержат значительное количество белков, связанных с нейрональной дифференцировкой клеток и приобретения ими функциональной спецификации. Предварительно мы выявили, что ВВ НП-ИПСК содержат мРНК генов-маркеров нейрональной дифференцировки (Pax6, Nestin,TUBBIII, Map2 и S100B). Показано, что при добавлении таких внеклеточных везикул в среду культивирования ИПСК-ч (среда N2B27), в этих клетках уже на 7 сутки выявляются признаки ранней нейрональной дифференцировки - экспрессия гена FoxA2.Регуляторный эффект определяется концентрацией добавляемых ВВ. Исследование химического состава ВВ от ИПСК-ч и НП-ИПСК-ч методами рамановской спектроскопии показало полосы липидов, а также более выраженные для ВВ НП-ИПСК полосы нуклеиновых кислот и белков, содержащих ароматические структуры. Хемометрический анализ рамановских спектров везикул с помощью алгоритмов PCA и PLS-DA показал, что спектральные данные ВВ ИПСК и ВВ НП-ИПСК различаются, но частично пересекаются. При исследовании дифференцировки ИПСК-ч в ППК-подобные клетки с применением разработанного протокола показали, что ИПСК-ч с трисомией 21 хромосомы в отличие от дифференцировки нормальных клеточных линий нарушается экспрессия гена NANOS3 - раннего маркера ППК. Экспрессия других, как ранних (PRDM1, PRDM14, STELLA и SSEA1), так и поздних маркеров ППК (DAZL и VASA), а также наличие белковых продуктов этих генов не различались.
4 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. Направленная дифференцировка клеток млекопитающих в системе in vitro.
Результаты этапа: Продолжили работу по анализу протеомных профилей внеклеточных везикул ИПСК человека и везикул популяций клеток, полученных в ходе их направленной нейральной дифференцировки. Функциональная аннотация представленности белков была проведена с использованием баз данных Reactom, GO CC (Gene Ontology Cell Component), GO BP (Gene Ontology Biological Processes), KEGG, а так же UniProt. С использованием программа STRING: functional protein association networks (http://www.string-db.org) провели изучение сети взаимодействия белков и прогноза функции белка, выявленных во ВВ нейральных производных ИПСК. Проведен анализ данных литературы о роли механических напряжений в ориентации клеток, клеточных дифференцировках и самоорганизации клеточных коллективов, а также о роли эластичных субстратов в организации клеточных популяций, и подобраны эластичные субстраты для проведению экспериментальных проверок влияния механических напряжений на дифференцировку клеток. Методом эписомальной трансдукции плюрипотентного состояния из клеток жировой ткани макаки-резуса (Macaca mulatta) были получены и охарактеризованы по критериям плюрипотентности ИПСК макаки-резуса, разработаны оригинальные протоколы их культивирования.
5 1 января 2025 г.-31 декабря 2025 г. Направленная дифференцировка клеток млекопитающих в системе in vitro.
Результаты этапа:
6 1 января 2026 г.-31 декабря 2026 г. Направленная дифференцировка клеток млекопитающих в системе in vitro.
Результаты этапа:
7 1 января 2027 г.-31 декабря 2027 г. Направленная дифференцировка клеток млекопитающих в системе in vitro.
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".