Изучение динамических процессов в биохимических и клеточных системахНИР

Studies of dynamical processes in biochemical and cellular systems

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. Изучение динамических процессов в биохимических и клеточных системах
Результаты этапа: Определены значения уровня маркеров окислительного стресса, в том числе 8-оксо-2’-дезоксигуанозина, в ДНК Saccharomyces cerevisiae зависимости от возраста и стрессовых воздействий. Проверена возможность использования в качестве маркера окислительного стресса 8-оксо-рибогуанозина, который образуется в различных типах РНК при стрессовых воздействиях. На модели воспаления исследована возможность применения маркеров окислительного стресса и действия противовоспалительных препаратов. Проведены исследования биологической активности пептидов в широких диапазонах концентраций на основе разрабатываемых при выполнении данной НИР клеточных модельных систем. Проведены полевые исследования на ЗБС МГУ по изучению спор зеленых мхов в модельных экспериментах по изучению биологической активности растительных пептидов. Продолжено изучение роли активных форм кислорода в клеточной сигнализации при участии регуляторных пептидов и белков. На основе задела по гравитационным и космическим исследованиям с модельными растительными системами получены новые данные по регуляции роста и развития растений. В рамках изучения активности в отношении водных систем наночастиц, в частности, углеродных наночастиц начато исследование влияния одностенных углеродных нанотрубок (ОУН) в широком диапазоне концентраций на сопровождающиеся люминесценцией окислительно-восстановительные процессы, протекающие в бикарбонатных водных системах с участием активных форм кислорода (АФК). Установлена нелинейная концентрационная зависимость влияния ОУН на процессы генерации АФК при достоверном влиянии препаратов ОУН на эти процессы в сверхвысоких разведениях. Начато сравнение действия на водные растворы ОУН с действием гидратированных фуллеренов. В рамках изучения влияния физических факторов среды, включая свет, на водные и биологические тест-системы начато исследование влияния на активные водные системы, включая бикарбонатные растворы и некоторые ферменты, водяного аэрозоля, обработанного ИК-излучением. Показано, что облученный аэрозоль достоверно влияет на физико-химические свойства водных систем и восстанавливает активность частично денатурированных ферментов. В рамках НИР были проведены и продолжаются поиск и разработка новых структур ингибиторов дипептидилпептидазы-4 (ДПП-4) на основе псевдо-ди- и трипептидов, содержащих в своем составе фрагменты природных и неприродных альфа- и неприродных бета-аминокислот. Синтезировано значительное количество химических соединений – потенциальных ингибиторов ДПП-4, часть из которых показали ингибирующую активность с показателем IC50 от 10 до 500 нмоль.
2 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. Изучение динамических процессов в биохимических и клеточных системах
Результаты этапа: В рамках работы по направлению «Маркеры окислительного стресса» установлено, что маркер окислительного стресса, основанный на рибогуанозине, на порядок чувствительнее, чем его дезокси-аналог, и быстрее отзывается на кратковременные воздействия, такие как изменение температуры, рН среды или концентрации соли и т.п. При культивировании клеточной культуры S. cerevisiae в стандартных условиях не обнаружено достоверных отличий в штамме Δpho3 по уровню 8-оксорибогуанозина по отношению к неокисленному гуанозину в РНК по сравнению с родительским штаммом и штаммом Δbgl2, а при изменении условий культивирования эти значения быстро возрастали в 3-4 раза – в отличие от показателей по ДНК. В рамках исследования роли свободно-радикальных процессов в поддержании динамического состояния водных систем, включающих водные растворы бикарбонатов и кровь продолжено изучение влияния однослойных нанотрубок и экстракта куркумы в широком диапазоне концентраций, полученных путем сотенных разведений с потенцированием исходных водных растворов на энергетические свойства природных гидрокарбонатных питьевых вод нескольких марок в сравнении c соответствующими потенцированными разбавлениями Милли-Q-воды. Установлено, что ОУН и контрольные Милли-Q-воды по-разному влияют на воды Биовита и Стелмас, а разведения куркумы по-разному влияют на воды Биовита и Светла Рус. Установлено, что среди самых высоких разведений ОУН (до 10-21) имеются те, что в виде 1% добавок статистически значимо усиливают активность вод Биовита и Стелмас. Разведения экстрактов Куркумы в диапазоне разведений по меньшей мере до 10-5 ослабляют люминесцентную активность тестируемых вод, причем этот эффект подавления сохраняется по меньшей мере в течение 3 дней. Был обнаружен новый факт: все потенцированные добавки контрольной ) Милли-Q-воды в отличие от обычной (интактной) Милли-Q-воды уменьшают люминесцентную активность тестированных гидрокарбонатных вод. Этот результат еще раз подтверждает существенное воздействие на структурные параметры воды не только молекулярных субстанций, входящих в состав исходных подлежащих разведению растворов, но и их специальной физической обработки, в данном случае энергичного встряхивания-перемешивания на шейкере. Активирующие эффекты потенцированных разведений ОУН указывают, что эти наночастицы подобно гидратированному фуллерену С60 (HyFnC60) могут проявлять прооксидантную активность, а ингибирующие эффекты разведений Куркумы вплоть до самых высоких отражают известную ярко выраженную антиоксидантную активность этой уникальной специи. При исследовании влияния HyFnC60 в широком диапазоне концентраций на люцигенин-зависимую хемилюминесценцию (ЛЦ-ХЛ) крови здоровых доноров и госпитальных пациентов с ХОБЛ, было установлено, что HyFnC60 в концентрациях вплоть до 10-19 М усиливает ЛЦ-ХЛ крови здоровых доноров, в то время как на кровь пациентов с ХОБЛ он оказывал противоположный эффект. Это можно интерпретировать как то, что в крови здоровых доноров выработка активных форм кислорода (АФК) усиливается HyFnC60, в то время как у пациентов с хроническим воспалительным заболеванием с уже повышенной выработкой АФК она ослаблена. Это указывает на то, что препараты HyFnC60 даже в сверхвысоких разведениях могут играть роль регулятора процессов с участием АФК. В рамках направления: Изучение регуляторной роли пептидов в росте и развитии растений и животных» показано, что пептидная регуляция носит универсальный характер в организмах, принадлежащих к разным систематическим группам, которые относятся к животным и растениям. Установлены новые закономерности регуляции сигнальных и физиологических процессов известными пептидными фитогормонами из класса системинов Проведено изучение возможной роли активных форм кислорода в клеточной сигнализации при участии регуляторных пептидов и белков. В рамках направления «Поиск и разработка синтетических биорегуляторов - псевдо-ди и три-пептидов, ингибиторов фермента дипептидилпептидазы-4 (ДПП-4)» выявлено соединение-лидер с показателем ДПП-4-ингибирующей активности - IC50~10-11 нМ. По этому и другим показателям (скорости расщепления хромогенного субстрата ДПП-4, стабильности ингибирующей активности на протяжении исследуемого отрезка времени и первично оцененной цитотоксичности) вещество сравнимо с известными лекарственными препаратами-ингибиторами ДПП-4.
3 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. Изучение динамических процессов в биохимических и клеточных системах
Результаты этапа: В РАМКАХ ИССЛЕДОВАНИЯ ПО НАПРАВЛЕНИЮ «Системное изучение регуляторной роли пептидов в росте и развитии растений и животных» проведен системный анализ пептидов растительных организмов и изучения биологической активности низкомолекулярных пептидов. Проведены исследования, направленные на выявление биологической активности новых пептидов, выделенных из модельного организма Physcomitium patens. Эксперименты по оценке биологической активности пептидов проведены в широком диапазоне концентраций. Продолжены полевые исследования на ЗБС МГУ, включая сбор и анализ спор зеленых мхов в рамках модельных экспериментов по изучению биологической активности растительных пептидов. В РАМКАХ ИССЛЕДОВАНИЯ ПО НАПРАВЛЕНИЮ «Выяснение роли свободно-радикальных процессов в поддержании динамического состояния водных систем, включающих водные растворы бикарбонатов - моделях биологических жидкостей, и влияния на них биологически активных веществ». С использованием хемилюминесцентного и спектрального методов исследовали влияние на энергетическую активность и физико-химические свойства бикарбонатных водных растворов (БВР), включающих в себя растворы NaHCO3 (5 мМ) и ряд минеральных вод добавления к ним (0,001 – 0,01%) и люминола (ЛМ) и интенсивного их перемешивания (динамизации). Показано, что интенсивность хемилюминесценции (ХЛ), отражающая энергетическую активность вод после динамизации растворов даже через 4 недели остается более высокой, чем в контроле. Интенсивность ХЛ БВР, к которым исходно добавляли H2O2 (0,01%) и люминол (ЛМ), в 80-100 раз превышала интенсивность ХЛ БВР без добавок. Интенсивность ХЛ динамизированных БВР уже через 1 сутки на 50-70%, при хранении образцов в герметично закрытых пробирках она превышала интенсивность ХЛ контрольных образцов БВР. Эти результаты свидетельствовали, что динамизация БВР активирует длительно протекающие в них процессы, сопровождающиеся генерацией электронного возбуждения, даже в условиях изоляции от внешней среды. В ходе многодневного хранения динамизированных растворов NaHCO3 в герметично закрытых пробирках при их спектральном анализе выявляется выраженный пик поглощения вблизи 270 нм. Этот пик характерен для структурированной воды, получившей название «Вода исключающей зоны» (Exclusion zone water, EZ-water). Это позволяет предположить, что при динамизации БВР происходит их данимаческая структуризация. Динамизация минеральных вод (Биовита, Светла, исходной скважинной воды) сопровождалась увеличением их ХЛ, а также увеличением рН, электропроводности и снижении окислительно-восстановительного потенциала. Хранение вод после динамизации в закрытых пластиковых бутылках позволяет как бы «законсервировать» полученные от механической обработки эффекты. Повышенная ХЛ сохранялась на протяжении как минимум 17 дней практически для всех изучаемых вод, хотя между разными водами сохранялись значимые различия. Добавление к необработанным водам всего 1% (по объему) динамизированной воды приводило к изменению их характеристик в сторону, характерную для динамизированных вод. Таким образом, БВР представляют собой сильно неравновесные системы, в которых непрерывно протекают реакции с участием АФК, в ходе которых освобождается энергия высокой плотности. Их интенсивность возрастает при механическом воздействии на БВР. Т.е., интенсивное перемешивание, турбулентное движение природных вод, которые представляют собой БВР, приводит к их активации. Поскольку БВР являются субстанциональной основой живой материи, характерные особенности динамических процессов, протекающих в БВР, могут реализоваться в процессах жизнедеятельности. В РАМКАХ ИССЛЕДОВАНИЯ ПО НАПРАВЛЕНИЮ «Маркеры окислительного стресса» Были продолжены работы по влиянию различных стрессовых факторов на уровни маркеров окислительного стресса, 8-оксо-2’-дезоксигуанозина в ДНК и 8-оксо-гуанозина в РНК Saccharomyces cerevisiae с целью выяснения того, влияют ли мутации в геноме дрожжей на окислительный стресс в клетках мутантных штаммов и изучения возможности использования 8-oxo-dG и 8-оксо-гуанозина в качестве биомаркеров оксидантного статуса клеточной культуры. Разработан точный, селективный, чувствительный метод определения 8-oxo-dG и 8-oxo-rG с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с амперометрической детекцией. Показано, что на начальной стадии культивирования клеток и во время экспоненциального роста клеточной культуры 8-оксо-рибогуанозин на порядок более чувствительный маркер оксидантного статуса клеток, чем его ДНК-аналог. На штаммах дрожжей с делециями генов Pho3p и Bgl2p относительно дикого штамма показано, что уровень маркера окислительного стресса 8-оксо-рибогуанозина, который образуется в различных типах РНК Saccharomyces cerevisiae в мутантных штаммах, не отличается от уровня маркера для штамма дикого типа. На основе модельных систем Saccharomyces cerevisiae исследовали зависимость значения уровня маркеров окислительного стресса от стрессовых факторов, таких как рН, температура, различные концентрации солей и т. п. Смена условий среды, интенсификация митохондриального и микросомального окисления, воздействие облучения и токсических агентов приводили к интенсивному образованию активных форм кислорода (АФК) и последующему окислению биомолекул, в том числе и нуклеиновых кислот. Показано, что маркер окислительного стресса, основанный на рибогуанозине, на порядок чувствительнее, чем его дезокси-аналог, и быстрее отзывается на кратковременные воздействия, такие как изменение температуры, рН среды или концентрации соли и т.п. При культивировании клеточной культуры Saccharomyces cerevisiae в стандартных условиях не обнаружено достоверных отличий в штамме Δpho3 по уровню 8-оксорибогуанозина по отношению к гуанозину в РНК по сравнению с родительским штаммом и штаммом Δbgl2, а при изменении условий культивирования эти значения быстро возрастали в 3-4 раза – в отличие от показателей по ДНК. В РАМКАХ ИССЛЕДОВАНИЯ ПО НАПРАВЛЕНИЮ «Поиск и разработка синтетических биорегуляторов - псевдо-ди и три-пептидов, ингибиторов фермента дипептидилпептидазы-4 (ДПП-4)» проводилась работа по поиску модификаций разработанного ранее ингибитора ДПП-4 (IC50 10-11 нмоль) с целью улучшения показателей ингибирующей активности, стабильности и уменьшения цитотоксичности. Результатом этой работы за год стала разработка модификации с улучшенным показателем IC50 до 4 нмоль. На первом этапе этой части работы применяли метод молекулярного моделирования для выявления теоретически перспективных модификаций. Из общего числа расчетных модификаций были выбраны две. Для первичной оценки соответствия теоретических расчетов с экспериментальными результатами ДПП-4 ингибирующей активности были разработаны общие методы получения представителей этих модификаций и осуществлен синтез 4 соединений. Для доказательства их структуры и чистоты применялись LС/MS, ЯМР спектроскопия и элементный анализ. Исследования ингибирующей ДПП-4-активности полученных модифицированных псевдопепдидов проводились спектрофотометрическим методом. В качестве субстрата использовали 2 сертифицированных рекомбинантных фермента ДПП-4 – D4943 (Sigma-Aldrich) и D3446 (Sigma-Aldrich) и субстрат Gly-Pro-п-нитроанилид. По результатам исследования 4 четырех синтезированных соединений были получены показатели IC50, которые варьировались от 4 нмоль до 160 нмоль, в зависимости от конкретной модификации. В трех случаях из 4-х экспериментальные результаты хорошо коррелировали с теоретическими расчетами, выполненными методом молекулярного моделирования. Была выявлена зависимость ингибирующей активности не только от пространственной (стерео) конфигурации молекулы, но и от положения атомов азота и кислорода в модифицированной части. Начаты исследования по оценке ингибирующей активности по отношению к ферментам ДПП-7 и ДПП-8, которые являются родственными ДПП-4. Первичная проверка не выявила активности к ДПП-7 и ДПП-8, но более детальные эксперименты будут продолжены. Также был проведен эксперимент с целью первичной оценки токсического действия, оказываемого на клеточную культуру, одного из модифицированных соединений с лучшим показателем IC50 (4 нмоль). По результатам был сделан предварительный вывод об умеренной цитотоксичности исследованного соединения.
4 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. Изучение динамических процессов в биохимических и клеточных системах
Результаты этапа: НАПРАВЛЕНИЕ: «СИСТЕМНОЕ ИЗУЧЕНИЕ РЕГУЛЯТОРНОЙ РОЛИ ПЕПТИДОВ В РОСТЕ И РАЗВИТИИ РАСТЕНИЙ И ЖИВОТНЫХ». Фундаментальная роль пептидов в росте и развитии высших растений, включая ряд сельскохозяйственных культур, установлена благодаря высокопроизводительной масс-спектрометрии и использованию модельных тест-систем, которые играют критическую роль в установлении биологической активности новых пептидов. Разработанные в ходе НИР модельные системы применяются для выявления регуляторного потенциала пептидов в широких диапазонах концентраций. Получены новые данные по регуляции клеточных делений и развития растений на клеточном уровне при участии новых пептидов, открытых при выполнении настоящего проекта. Исследования биологической активности известных пептидных фитогормонов из класса системинов и пептидных элиситоров в рамках текущего исследования позволили выявить новые закономерности в регуляции сигнальных и физиологических процессов. Разработанные в ходе НИР модели на основе гаметофоров мхов находят применение в области гравитационной фотобиологии для изучения биофизических механизмов регуляции роста и развития растений. Продолжение изучение регуляторной активности сигнальных пептидов растений, запланированное в рамках данного проекта, представляет большой интерес, так как эти пептиды обладают потенциалом использования в качестве регуляторов роста и высокоэффективных агентов системного действия для защиты сельскохозяйственных культур при применении в сверхнизких концентрациях. НАПРАВЛЕНИЕ: «ВЫЯСНЕНИЕ РОЛИ СВОБОДНО-РАДИКАЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ В ПОДДЕРЖАНИИ ДИНАМИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ ВОДНЫХ СИСТЕМ, ВКЛЮЧАЮЩИХ ВОДНЫЕ РАСТВОРЫ БИКАРБОНАТОВ - МОДЕЛЯХ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ И КРОВЬ, И ВЛИЯНИЯ НА НИХ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ». Основное внимание при работе по данному направлению в отчетный период было уделено изучению влияния обработанного ИК-облучением водяного аэрозоля на физико-химические свойства водных систем, а также на биологические тест-системы, такие, как водные растворы ряда ферментов, на продолжительность жизни плодовых мушек дрозофил и на антиоксидантный статус людей, вдыхавших обработанный ИК-излучением водяной пар. Исследования проводили совместно с сотрудниками ИБХФ РАН. Было показано, что обработка (обдувание) ИК-облученным водяным аэрозолем водных систем (дистиллированной воды, минеральных вод, бикарбонатного и фосфатного буферных растворов) влияет на целый ряд их физико-химических свойств, причем эти изменения держатся до 48 часов после кратковременной (1-3 минуты) обработка водных систем. Обдувание водных растворов ряда ферментов помогает частично сохранить активность ферментов при термической и окислительной денатурации, более того, в ряде случаев после обработки растворов уже инактивированных ферментов облученным ИК аэрозолем наблюдается частичное восстановление их активности. Обработка льда ИК 4000 нм во время его таяния приводит к появлению пика 270 нм в спектре поглощения и к изменениям в спектре ИК-поглощения талой воды. Обработка ИК-облученным водным аэрозолем дрозофил увеличивает выживаемость мух в обычных условиях и в условиях окислительного стресса. Ингаляции ИК-обработанным водным аэрозолем приводят к увеличению общей антиокислительной активности слюны здоровых доноров, что отражается в увеличении содержания антиоксидантов в слюне. Мы предполагаем, что при ИК-облучении водяного аэрозоля в нем увеличивается относительное содержание водных структур, обладающих восстановительными свойствами, подобных «исключающей зоне» воды (EZ-вода), подробно описанной Дж. Поллаком (G. H. Pollack), а при обдувании таким аэрозолем жидкой воды в ней индуцируется усиленной формирование доменов со свойствами EZ-воды. Последующие исследования будут направлены на исследования влияния ИК-облученного пара на другие свойства жидких водных систем и на проверку выдвинутой нами гипотезы. НАПРАВЛЕНИЕ: «МАРКЕРЫ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА». Показано, что маркер окислительного стресса, основанный на рибогуанозине, на порядок чувствительнее, чем его дезокси-аналог, и быстрее отзывается на кратковременные воздействия, такие как изменение температуры, рН среды или концентрации соли или ионизирующее излучение. Наши результаты показали, что при культивировании клеточной культуры Saccharomyces cerevisiae в стандартных условиях не обнаружено достоверных отличий в штамме Δpho3 по уровню 8-оксорибогуанозина по отношению к гуанозину в РНК, по сравнению с родительским штаммом и штаммом Δbgl2, а при изменении условий культивирования эти значения быстро возрастали в 3-4 раза – в отличие от показателей по ДНК. По нашему мнению, это означает, что изменение условий культивирования приводит к изменению окислительного статуса клетки, но репарационная система, связанная с защитой генома, вполне справляется с такими изменениями, и уровень ДНК-маркера не изменяется, в отличие от уровня РНК-маркера. При изучении влияния ионизирующего излучения на уровень маркеров окислительного стресса необходимо придерживаться неких физиологических норм – по меньшей мере, работать с клетками, получившими дозу радиации и при этом сохранили свой пролиферативный потенциал. НАПРАВЛЕНИЕ: «ПОИСК И РАЗРАБОТКА СИНТЕТИЧЕСКИХ БИОРЕГУЛЯТОРОВ - ПСЕВДО-ДИ И ТРИ-ПЕПТИДОВ, ИНГИБИТОРОВ ФЕРМЕНТА ДИПЕПТИДИЛПЕПТИДАЗЫ-4 (ДПП-4)». В результате проведенных исследований выявлена достаточно высокая и сравнимая с коммерческими лекарственными препаратами (глиптинами) селективность разработанных нами ДПП-4-ингибиторов. Нежелательное ингибирование родственных ферментов ДПП-8 и ДПП-9 исследованными соединениями достигается лишь при высоких и абсолютно не физиологических концентрациях. Токсическое действие наших образцов оценено в in vitro экспериментах как умеренное и сопоставимое с аналогичными показателями лучших коммерческих зарубежных препаратов-аналогов, присутствующих на российском рынке. Первичные результаты свидетельствуют о бОльшей химической стабильности модифицированной молекулы по сравнению с базовой, что хорошо коррелирует с теорией. Предварительный вывод: по совокупности всех показателей (активность-стабильность-избирательность-токсичность, полученных на сегодняшний день, модифицированная молекула представляется более перспективной, чем базовая структура. Исследования продолжаются.
5 1 января 2025 г.-31 декабря 2025 г. Изучение динамических процессов в биохимических и клеточных системах
Результаты этапа:
6 1 января 2026 г.-31 декабря 2026 г. Изучение динамических процессов в биохимических и клеточных системах
Результаты этапа:
7 1 января 2027 г.-31 декабря 2027 г. Изучение динамических процессов в биохимических и клеточных системах
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".