Принципы ультраструктурной организации интерфазных и митотических хромосомНИР

Principles of the ultrastructural organization of interphase and mitotic chromosomes

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. Принципы ультраструктурной организации интерфазных и митотических хромосом
Результаты этапа: 1) Проведена трехмерная реконструкция строения политенных хромосом антиподальных клеток пшеницы, используя конфокальную микроскопию, изучена ультраструктура политенных хромосом методом ТЭМ. Исследовния проводились как на интактных ядрах, так и на выделенных политенных хромосомах. Для этого была разработана методика и получены препараты распластанных индивидуальных политенных хромосом растений. С помощью трехмерной реконструкции выявлены особенности локализации теломерных участков, идентифицируемых методом FISH по разработанному нами протоколу, в ядрах антиподального комплекса на разных этапах дифференцировки и гибели. Выявлены структурно-функциональные особенности основных компартментов ядер антиподальных комплексов оплодотворенных и неоплодотворенных зародышевых мешков пшеницы в ходе дифференцировки и ПКГ. С помощью методов световой и трансмиссионной электронной микроскопии были изучены основные характеристики ядер клеток антиподального комплекса на стадии гибели. Было показано, что ядра клеток с политенными хромосомами меняют свою структуру, а компоненты (белки и РНК) ядрышка перемещаются в область политенных хромосом, происходит экструзия гранулярного компонента ядрышка и частей хроматина в цитоплазму через разрывы ядерной оболочки. Впервые показано наличие разрывов в ДНК по методу TUNEL. 2) Проведен поиск ядерных мишеней, на которые влияют изменения экспрессии изоформ актина. Выявлены иммуноцитохимические и морфологические различия ядер и ядерных структур: изменения морфологии ядра и хроматина, накопление ламина B в ядерной оболочке. Были исследованы морфология и распределение ядерных телец, а также уровень экспрессии и накопления ядрышковых белков. Выявлены возможные функции β-актина: контроль размера ядра, плоидности и упаковки хроматина; поддержание стабильности ядерной оболочки. Напротив, возможные функции γ-актина заключаются в декомпактизации хроматина и снижении стабильности ядерной оболочки. 3) Для точного определения структуры хроматина в ходе репликации была использована корреляционная световая и электронная микроскопия. С использованием разработанного ранее алгоритма производилоть точное совмещение изображений ультратонкого среза, сделанного во флуоресцентном и электронном микроскопе. Затем в изоббражении с флуоресцентного микроскопа выделяли контуры репликационных контуров и определяли в их составе наиболее яркие точки (считая их наиболее вероятными локусами расположения реплицирующегося хроматина, границы были заведомо шире зон реплицирующегося хроматина из-за дифракционных явлений). Затем в выделенных границах на электронно-микроскопических изображениях проводили сегментацию конденсированного и деконденсированного хроматина. Таким образом получали несколько характеристик - долю конденсированного хроматина в границах репликационного комплекса, положение реплицирующегося хроматина (наиболее яркой точки) относительно конденсированного и диффузного хроматина, а также характеристику плотности конденсированного хроматина. В результате показано, что репликация у растений с гигантским геномом происходит либо в диффузном хроматине, либо на границе диффузного и конденсированного хроматина (в средней S-фазе). При репликации интерфазных хромонем в средней S-фазе происходит изменение структуры конденсированного хроматина, который становится менее однородным. После завершения репликации конденсированный хроматин обратно конденсируется, т.е. отложенная метка (картированная тем же методом) локализуется в конденсированном хроматине, структура которого более однородна, чем в ходе репликации. Таким образом, получена количественная характеристика изменений структуры хроматина в ходе репликации и после ее завершения.
2 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. Принципы ультраструктурной организации интерфазных и митотических хромосом
Результаты этапа: 1) Изучали влияние изменений экспрессии цитоплазматических изоформ актина на структуру ядра нормальных фибробластов человека. Проведена работа по поиску и исследованию неизвестных ранее функций цитоплазматических изоформ бета и гамма актина, связанных с клеточным ядром фибробластов. В работе были использованы методы культивирования первичных культур фибробластов человека различного тканевого происхождения. Для первичного скрининга были использованы методы РНК-интерференции, иммуноблоттинга, иммунофлуоресцентного окрашивания цитоскелетных структур, классической световой микроскопии, а также морфометрии с использованием компьютерных программ. С использованием иммунофлуоресцентной микроскопии в клетках с измененным соотношением уровня экспрессии бета и гамма изоформ актина проводится изучение изменений морфологии ядра и хроматина, аккумуляции ламинов А и В, влияющих на жесткость ядра, исследуется распределение гистонов, белков ядерных телец (спеклов), а также фибрилларина в ядре. 2) Исследовали организацию интерфазных ядер в корешках 10-15 разных видов растений с разными размерами генома методами электронной микроскопии. Для определения природы нитевидных комплексов конденсированного хроматина в интерфазных ядрах некоторых растений нами было проведено ультраструктурное исследование организации ядер 24 видов растений с разным размером генома. При этом число хромосом не должно было быть меньше 6 и больше 16 на гаплоидный набор. Для анализа брали клетки корневой меристемы, так как в этой области число митозов относительно невелико и можно считать, что все клетки находятся в одном состоянии (стадия G0). В результате проведенного исследования ядра были классифицированы на три группы. (1) Ядра с хромоцентрическими ядрами, содержащие небольшие округлые блоки гетерохроматина в контакте с ядерной оболочкой или ядрышком. Иногда гетерохроматин имел удлиненную форму, но преимущественно округлая форма и локализация в контакте с оболочкой и/или ядрышком являлись хорошими признаками для определения этого типа ядер. (2) Ядра с комплексами хроматина, рассеянными по всей нуклеоплазме. Количество гетерохроматина варьировало в широких пределах и, парадоксально, четкой корреляции с размером генома не было. (3) Ядра с хромонемной организацией. В этом случае ядро заполняла сеть анастомозирующих фибрилл гетерохроматина. В большинстве случаев, эта сеть включала большую часть наблюдаемого на единичном срезе гетерохроматина. Другим признаком была возможность проследить эти нити от одного края ядра до противоположного. По размеру генома эти три группы распались также на три класса, соответственно, с маленьким, средним и большим геномом (данные взяты из The Plant DNA C-values Database). Было определено содержание тандемных повторов в геноме Nigella damascena. Большая часть генома образована LTR (50%). 3) При помощи разработанного нами метода недеструктивного мечения новосинтезированной ДНК в культивируемых клетках млекопитающих на ультраструктурном уровне исследована надмолекулярная организация эухроматических районов хромосом. Методами локализационной микроскопии и электронной томографии показано, что транскрибирующиеся хромосомные локусы организованы в виде хромонемных фибрилл с диаметром около 200 нм, таким образом подтверждая ранее высказанную гипотезу о возможности осуществления матричного синтеза нуклеиновых кислот (транскрипция и репликация) на высококомпактизованной хроматиновой матрице. Разработана процедура корреляционной оптической микроскопии с суперразрешением (STORM) и электронной томографии с использованием бинарных меток, а также алгоритмы анализа линейных размеров хроматиновых доменов на томограммах клеток на основании распределения электроноплотных меток. 4) Локализованы теломерные и центромерные участки политенных хромосом антиподальных клеток пшеницы в интактных ядрах и на выделенных хромосомах. С помощью трехмерной реконструкции выявлены особенности локализации теломерных и центромерных участков в ядрах антиподального комплекса на разных этапах дифференцировки и гибели. Получены 3D реконструкции ядер клеток антиподальных комплексов с использованием широкопольной флуоресцентной и конфокальной микроскопии. Предложена модель структуры политенных хромосом растений.
3 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. Принципы ультраструктурной организации интерфазных и митотических хромосом
Результаты этапа: За отчетный период были проведены исследования ультраструктурной организации политенных хромосом антиподального комплекса зародышевого мешка пшеницы. В результате измерений минимальная толщина фибриллы составила 0,09 – 0,15 мкм. Наиболее часто данные фибриллы переплетались, образуя более крупные фибриллы величиной 0,2 – 0,3 мкм. Анализ структуры политенной хромосомы антиподальных клеток показывает, что тело хромосомы построено из параллельно расположенных толстых фибрилл, образованных двумя тонкими переплетающимися фибриллами, которые, переплетаясь между собой, образуют крупные цепочки. В дальнейшем все фибриллы, образующие плечо хромосомы, подвергаются дополнительной спирализации. Отдельные фибриллы разобщены в области теломерных участков, ассоциированных с ядерной оболочкой. Также изучалось влияние изменений экспрессии цитоплазматических изоформ актина на структуру хроматина в интерфазном ядре нормальных фибробластов человека. Исследовались изменения в структурной организации и локализации специфических ламина-ассоциированных доменов клеточного ядра при изменении соотношения изоформ актин бета и гамма. В клетках со сниженной экспрессией бета-актина были выявлены: увеличение площади ядра и плоидности, уменьшение количества линкерного гистона Н1 и коровых гистонов Н2А, Н2В, Н3; количественное изменение белков ядерной ламины (уменьшению ламина А/С и увеличению ламина В. На основании полученных результатов предполагается возможная роль бета изоформы актина в компактизации хроматина и регуляции соотношения ламинов в ядерной оболочке; Исследовали экспрессию, созревание и внутриклеточное распределение одиннадцати цистеиновых катепсинов в эмбриональных клетках почек HEK293 и клеточных линиях рака почки 769-P и A-498. Все цистеиновые катепсины присутствуют в различных количествах в ядре как эмбриональных, так и опухолевых клеток. Примечательно, что более половины катепсина Z или K и более 88% катепсина F локализованы в ядрах опухолевых клеток. Более того, зрелые формы цистеин-катепсинов более распространены в опухолевых клетках, чем в эмбриональных клетках.
4 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. Принципы ультраструктурной организации интерфазных и митотических хромосом
Результаты этапа: 1. Синтезированы потенциальные ингибиторы ZMPSTE24 и определены IC50 на модели фибросаркомы человека HT-1080. Показано, что наиболее нетоксичными являются зофеноприл и фозиноприл из класса ингибиторов ангиотензин-конвертирующего фермента. При помощи вестерн-блоттинга по изменению соотношения зрелой и незрелой форм ламина А определена эффективность синтезированных ингибиторов. 2.Методом FISH иследована пространственная локализация хромосомных территорий Х-хромосомы в при дестабилизации ядерной оболочки-ламины осмотическим шоком in vivo на фоне ингибирования созревания ламина А. Показано, что Х-хромосома в клетках HeLa показывает аномально высокую частоту локализации в индуцированных осмотическим шоком ядерных почках независимо от уровня непроцессированной формы ламина А. 3. Методами LSM и морфометрии выявлены изменения структурной организации и локализации белков нуклеоскелета при изменении экспрессии различных изоформ актина. Подготовлены образцы для ультраструктурного анализа клеток с изменениями уровня экспрессии бета-актина. 4. Получен массив данных для морфометрического анализа ультраструктурной организации политенных хромосом антиподов пшеницы. Методами FISH с теломерными пробами проанализирована степень политенизации хромосом антипод на разных стадиях развития. Образцы подготовлены для электронно-микроскопического исследования морфологии политенных хромосом в зависимости от степени политенизации.
5 1 января 2025 г.-31 декабря 2025 г. Принципы ультраструктурной организации интерфазных и митотических хромосом
Результаты этапа:
6 1 января 2026 г.-31 декабря 2026 г. Принципы ультраструктурной организации интерфазных и митотических хромосом
Результаты этапа:
7 1 января 2027 г.-31 декабря 2027 г. Принципы ультраструктурной организации интерфазных и митотических хромосом
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".