Молекулярно-генетические механизмы нестабильности генома и мутагенеза у животных и человекаНИР

Molecular-genetic mechanisms of genome instability and mutagenesis in animals and humans

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. Молекулярно-генетические механизмы нестабильности генома и мутагенеза у животных и человека
Результаты этапа: Мобильные генетические элементы (МГЭ) являются постоянным компонентом генома эукариотических организмов. Транспозиционная активность МГЭ является мощным мутагенным фактором: при перемещении, МГЭ могут переносить различные регуляторные элементы, способные повляить на экспрессию генов, а инсерции МГЭ в экзоны обычно необратимо нарушают функционирование гена. Неконтролируемые перемещения МГЭ оказываются опасны для хозяина, поэтому транспозиционная активность контролируется различными механизмами. Считается, что один из важнейших путей контроля транспозиции МГЭ - это система Piwi-зависимой РНК-интерференции. У дрозофилы источником интерферирующих РНК для Piwi-зависимой РНК-интерференции являются кластеры, содержащие множество копий различных МГЭ. Самые известные из них это 42AB и flamenco. Повышение транскрипционной и транспозиционной активности МГЭ группы gypsy указывает на фенотип flamenco-, который может быть связан с нарушением работы самих локу- сов flamenco и 42AB, либо мутацией в другом гене, участвующем в процессинге РНК-предшественника. В нашей лаборатории используется модельная система из двух линий дрозофил с фенотипом flamenco-: линия MS, имеющая транспозиционно активную копию МГЭ gypsy и демонстрирующая генетическую нестабильность, а также изогенная с ней стабильная линия SS, не имеющая транспозиционно активного gypsy. Одной из наших целей является исследование генетической природы нарушения контроля активности МГЭ у этих линий. Ранее мы проводили секвенирование транскриптома этих линий методом Illumina и обнаружили ряд особенностей, связь которых с фенотипом flamenco- мы в настоящее время исследуем. Помимо линий SS и MS мы исследуем также нарушение транспозиционной активности МГЭ группы gypsy у мутантов по генам Piwi-зависимой РНК-интерференции. В контроле активности МГЭ также принимают участие гетерохроматиновые белки. Ранее в нашей лаборатории было исследовано in vitro взаимодействие гетерохроматиновых белков семейства HP1 c регуляторными участками ретротранспозонов группы gypsy. Показано, что белки семейства HP1 эффективно связываются с 5’-нетранслируемой областью ретротранспозонов, имеющих в ее составе тандемные повторы. Не менее важна эволюционная роль МГЭ. Очевидно, что мутации, связанные с перемещением МГЭ, а также перемещение регуляторных элементов увеличивают генетическое разнообразие внутри вида и предоставляют материал для естественного отбора. Наличие повторяющихся последовательностей (в том числе вставок различных МГЭ) даёт возможность для прохождения неравного кроссинговера, который, в свою очередь, может приводить к хромосомным перестройкам и дупликации генов. Кроме этого, МГЭ могут подвергаться молекулярной доместикации - их гены могут адаптироваться для выполнения функций, полезных для организма-хозяина.
2 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. Молекулярно-генетические механизмы нестабильности генома и мутагенеза у животных и человека
Результаты этапа: Проведено исследование участия гена rhino в контроле активности мобильных элементов в генеративных и соматических тканях. Белок rhino является гетерохроматиновым белком семейства hp1. Основная его задача заключается в распознавании гетерохроматиновых меток H3K9Me3 для запуска транскрипции двуцепочечных кластеров piРНК с неканонических стартов и запрете последующего сплайсинга их РНК. Однако ранее роль rhino не изучалась за пределами генеративных тканей, хотя за последнее десятилетие накопилась информация о том, что piРНК может участвовать в регуляции различных процессов, включая онтогенез, в соматических тканях различных животных. В связи с этим для исследования взяли три части (корпусы, головы и яичники) контрольных гибридов и гибридов с нокдауном гена rhino во всех тканях, чтобы измерить экспрессию ряда мобильных элементов и кластеров в экспериментальной выборке относительно контрольной. Оказалось, что при снижении экспрессии rhino активность некоторых мобильных элементов повышается не только в генеративных тканях, но и в соматических. Также обнаружено, что эффект нокдауна rhino сказывается не только на уровне экспрессии кластеров в яичниках, но и в голове дрозофилы. Таким образом, от rhino зависит экспрессия мобильных элементов не только в яичниках, но и во всём теле. Результаты данной работы были освещены в докладах на двух конференциях и готовятся к публикации. Также мы исследовали влияние мутации в гене piwi на активность мобильных элементов и кластеров piРНК. В настоящий момент проводим дополнительные исследования для проверки данных, полученных в результате этого эксперимента. Другим направлением является исследование причин активации мобильных элементов в ответ на стрессовое воздействие. В продолжение прошлых экспериментов в этом году проведен анализ экспрессии кластеров piРНК в ответ на воздействие персульфата аммония и сравнили с результатами по экспрессии исследуемых ретротранспозонов. Также в настоящее время проводится биоинформатический анализ результатов секвенирования с помощью технологии Oxford Nanopore для поиска новых инсерций мобильных элементов в исследуемых линиях и предсказания сайтов связывания транскрипционных факторов у этих вставок. С целью исследования мобильного компонента, было проведено нанопоровое секвенирование геномов линий с нарушением контроля мобильных элементов. Были выделена ДНК из D. melanogaster линии MS, SS (w, flamenco-)., piwi2, линия, прошедшая насыщающее скрещивание MS на линию дикого типа Canton-S (CantonS*MS_F10). Приготовленные библиотеки были секвенированы на приборе MinION (проточная ячейка FLO-MIN106D). Средний размере прочтений 3 800 п.н. Прочтения были картированы на геном D. melanogaster сборки BDGP6. С помощью анализа данных, полученных методом нанопорового секвенирования, были подтверждены 2 вставки МГЭ gypsy в ген f в интрон и экзон для линии MS и полученной линии CantonS*MS_F20. При сравнении генома линии MS, SS и CantonS*MS_F20 была обнаружена в линии MS инсерция МГЭ в 5’-нетранслируемую область гена su(f). Для линий SS и CantonS*MS_F10 данная вставка отсутствует. Супрессор forked ( su(f) ) является важным геном, который кодирует белок, участвующий в процессинге 3'-конца мРНК. Тем самым можно предположить, что на снижение продолжительности жизни в линии MS влияет инсерция МГЭ в 5’-нетранслируемую область гена su(f) вместе с инсерцией МГЭ gypsy в ген f. Для гибридной линии CantonS*MS_F20 была найдена точка кроссинговера между генами f и su(f),при этом локус flamenco у гибридной линии CantonS*MS_F10 получен от линии дикого типа, что так же может влиять на продолжительность жизни. Получена чистая линии от насыщающего скрещивания линии MS (w, flamenco-, f, активная копия gypsy). с линией дикого типа Canton-S (проведено 20 поколений скрещивания) (CantonS*MS_F20). При насыщающем скрещивании линии MS с линией Canton-S в каждом 2-м поколении количество генов от линии MS уменьшается в 2 раза. При проведении 20 насыщающих скрещиваний, с учетом получения рецессивных гомозигот в каждом 2-м скрещивании, генов от линии MS остается (½)^10, что составляет менее 0,1% в полученном гибриде. При получении гибридов в каждом поколении отбор производили по фенотипу опаленные щетинки (f). Полученная линия CantonS*MS_F20 продемонстрировала нормальную продолжительность жизни относительно линии дикого типа Canton-S, и увеличенную продолжительность жизни относительно линии MS. При анализе базы данных flybase.org на фенотипы с укороченной продолжительностью жизни, нами были отобраны гены, расположенные в границах рекомбинации гена f для гибридной линии CantonS*MS_F20. В генах, отвечающих за уменьшение продолжительности жизни mst, Usp2, Rab21, S6kII, stnB в линии MS относительно линии SS и CantonS*MS_F20 не было найдено мутаций. Для гена Coa7 обнаружен NSP, приводящий к замене аминокислоты. Но базе данных уменьшение продолжительности жизни наблюдается при нокауте этого гена, а не при различных его полиморфизмах. В рамках эколого-генетического исследования влияния диоксинов на жизнедеятельность мелких млекопитающих была изучена активность трех основных групп ретротранспозонов (ERV-L, LINE-1, B1-SINE) и ДНК-метилтрансферазы I у рыжих полевок, отловленных на территории, загрязненной 2,3,7,8-тетрахлордибензодиоксином (ТХДД) и другими диоксиноподобными соединениями. Обнаружено, что в условиях длительного хронического воздействия малых доз диоксинов у полёвок из природной популяции снижена активность ретротранспозонов подклассов B1 и L1 и увеличен уровень экспрессии гена DNMT1. Подавление активности ретротранспозонов и повышение экспрессии её эпигенетического регулятора (DNMT1) можно рассматривать как адаптивную стратегию к длительному хроническому воздействию малых доз диоксинов, загрязняющих среду. По полученным данным опубликована статья в журнале «Экология человека». Работа по подбору генетических маркеров диоксинового стресса в природных популяциях рыжей полевки была продолжена. На основании литературных данных, с помощью биоинформатических методов были подобраны праймеры к известным у человека и лабораторных животных маркерам воздействия диоксинов для работы с геномом полевки. В рамках исследования были отобраны образцы у животных с загрязненной территории (ТБО «Саларьево») и условно-контрольной виварной линии в разные сезоны (весна, осень). Проводился учет сезонных особенностей экспрессии эколого-генетических маркеров на уровне транскрипции. Было обнаружено, что в осенний период экспрессия большинства маркеров у экспонированных полевок была выше по сравнению с условно-контрольной выборкой животных. Весной же отличия по экспрессии были менее выраженными, т. к. в данный период времени в организм животных попадает меньше диоксиноподобных соединений. Активность некоторых метилтрансфераз сохранялась на одном уровне в популяции, отловленной на ТБО как весной, так и осенью. В условно-контрольной выборке экспрессия метилтрансфераз снижалась к осени. На основании полученных данных готовится статья для публикации в журнале «Генетика» или журнале «Экологическая генетика». Следующее направление исследования - роль витамина К и генетический контроль его метаболизма у Drosophila melanogaster. В рамках внутрифакультетской коллаборации совместно с Кафедрой Биохимии и в рамках межинститутской коллаборации совместно с Лабораторией Метаболомных Исследований ФГБУ «НМИЦ эндокринологии» Минздрава России проведены следующие исследования: Разработан протокол выделения витамина К из мух, и протокол его количественного масс-спектрометрического измерения в сложных биологических смесях. Впервые показано наличие витамина К в насекомых и измерено его количество. Проведены количественные измерения содержание витамина К2 в контрольных мухах и мухах, получавших синтетический аналог витамина К (препарат «Викасол») и ингибитора биохимического цикла витамина К (препарат «Варфарин»), показано увеличение содержания витамина К у мух, выросших на среде с «Викасолом» и уменьшение содержания витамина К относительно мух, получавших «Викасол», при добавлении к среде «Варфарина», что коррелировало с длительностью из жизни; Сконструированы экспрессионная плазмида несущая рекомбинантный ген гамма-глутамил карбоксилазы (GC) дрозофилы – ключевого фермента цикла витамина К, а также, плазмида потенциального субстрата фермента GC - белка SNX16. В рамках внутрифакультетской коллаборации совместно с Кафедрой Биофизики проведены следующие исследования. Разработан протокол определения уровня активных форм кислорода (АФК) у дрозофилы; проведены измерения уровня АФК у имаго, получавших в течение суток различные вещества (препарат «Викасол», персульфат аммония). Показано повышение общего уровня АФК у мух, получавших эти вещества, по сравнению с контрольными особями.
3 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. Молекулярно-генетические механизмы нестабильности генома и мутагенеза у животных и человека
Результаты этапа: Проведен поиск крупных инсерций и делеций в гены системы РНК-интерференции и в дифференциально экспрессируемые гены у линии с фенотипом flamenco SS и MS при анализе данных полногеномного нанопорового секвенирования. В исследуемых линиях SS и MS и линии дикого типа обнаружены инсерции и делеции МГЭ в эухроматиновые районы генома и в интроны генов относительно референсного генома. В частности, были обнаружены инсерции в интроны генов Piwi-зависимой РНК-интерференции: Argonaute 3 и Vasa. Проанализировано 65 генов с дифференциальной экспрессией для исследуемых линий SS и MS. Обнаружена инсерция МГЭ blood в области между генами CG17147 и Su(var)3-3 на расстоянии 478 п.н. после гена CG17147. Получена чистая линии от насыщающего скрещивания линии MS (w, flamenco-, f, активная копия gypsy). с линией дикого типа Canton-S (проведено 20 поколений скрещивания) (CantonS*MS_F20). При сравнении генома линии MS, SS и CantonS*MS_F20 была обнаружена в линии MS инсерция МГЭ в 5’-нетранслируемую область гена su(f). Это указывает на то, что снижение продолжительности жизни в линии MS связано с инсерцией МГЭ в 5’-нетранслируемую область гена su(f) вместе с инсерцией МГЭ gypsy в ген f. Для гибридной линии CantonS*MS_F20 была найдена точка кроссинговера между генами f и su(f),при этом локус flamenco у гибридной линии CantonS*MS_F10 получен от линии дикого типа, что дополнительно может влиять на продолжительность жизни. Проведено исследование влияния мутаций главных участников piРНК-интерференции: piwi и rhino. Для исследования piwi мы использовали реципрокные скрещивания линий piwi[2] и piwi[3] и сравнивали полученные результаты с родительскими линиями. Обнаружено, что в генеративных и в соматических тканях различные ретротранспозоны по-разному изменяют свою экспрессию в отличии от направления скрешивания. Таким образом, piwi играет роль в регуляции ретротранспозонов не только в яичниках, но и в соматических тканях. Различия в реципрокных скрещиваниях указывают на наличие у мутаций гена, piwi материнского эффекта. Провели нокдаун rhino во всём теле дрозофилы. Обнаружено, что кластер flamenco частично контролируется rhino, который, как считалось ранее, отвечает за транскрипцию только двуцепочечных кластеров. В рамках эколого-генетического исследования влияния диоксинов на жизнедеятельность мелких млекопитающих были отобраны образцы печени у животных с загрязненной территории (ТБО «Саларьево», ТБО «Кучино») и условно-контрольной виварной линии в разные сезоны (весна, осень).Предварительные результаты анализа экспрессии маркеров указывают на запуск процессов биотрансформации ксенобиотиков – повышенная экспрессия генов ahr, cyp1a2 у диких животных, отловленных осенью. Выборка полевок, отловленных весной на загрязненных диоксинами территориях в окрестностях свалки «Кучино», была значимо отличима от контрольной ей выборки полевок по показателям экспрессии генов, участвующих в эпигенетической регуляции активности генома.
4 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. Молекулярно-генетические механизмы нестабильности генома и мутагенеза у животных и человека
Результаты этапа: Проведён поиск в транскриптомных данных из образцов ЦНС Helix lucorum , которые были взяты в открытом доступе и обнаружили неполные последовательности ДКП-транспозонов. Наиболее близкие к обнаруженным последовательности ОРС gag обнаружились у наземной улитки Candidula unifasciata, принадлежащей к другому семейству. Степень сходства составляет около 60% (совпадающие + похожие аминокислоты). Схожий результат обнаруживается при поиске по последовательностям обнаруженных ОРС pol: наиболее близкими оказываются последовательности Candidula unifasciata, а если не брать моллюсков — последовательности рыб, иглокожих, кишечнополостных. Среди надёжно аннотированных последовательностей наиболее близкими к pol обнаруженных у Helix lucorum ретротранспозонов оказались ретротранспозоны группы gypsy дрозофилы и человеческие HERV-K. Обнаруженные нами у Helix lucorum ретроэлементы скорее всего являются ДКП-транспозонами, но не состоят в тесном родстве с ретроэлементами других брюхоногих. Для исследования регуляции экспрессии гена Gagr (доместицированный gag ретротранспозонов) было проведено исследование по добавлению персульфата аммония в корм разных видов дрозофилы. Обнаружено ослабление индукции экспрессии Gagr под действием персульфата аммония у мух, лишённых кишечной микрофлоры. Полученные данные указывают на то, что действие персульфата аммония и индукция Gagr могут объясняться, в первую очередь, повреждением пищеварительной системы и инфекцией. Для исследования действия витамина К (менандиона) проведено секвенирование транскриптома мух, подвергавшихся действию менандиона и варфарина на приборе NovaSeq и анализ полученных данных. Было обнаружено дополнительно более 100 генов АТФ-связывающих белков, которые уменьшают свой уровень экспрессии в ответ на варфарин. и более 200 генов мембран-ассоциированных белков, которые уменьшили свой уровень экспрессии в ответ на витамин К. В рамках исследования действия стойких экотоксикантов на геном, были изучены образцы печени животных, ранее отловленных в окрестностях полигона ТБО «Лесная» (Московская область, Серпуховский район) и полигона «Кучино» в разные сезоны. Профили экспрессии маркерных генов отличались от полученных в условно-контрольных линиях для всех изученных полигонов. Наблюдалось повышение экспрессии генов, ответственных, за рецепцию, трансформацию и окислительный стресс в осенний период. По всей видимости, это связано с сезонными изменениями в рационе животных и влиянием климатических условий на распространение диоксинов в среде.
5 1 января 2025 г.-31 декабря 2025 г. Молекулярно-генетические механизмы нестабильности генома и мутагенеза у животных и человека
Результаты этапа:
6 1 января 2026 г.-31 декабря 2026 г. Молекулярно-генетические механизмы нестабильности генома и мутагенеза у животных и человека
Результаты этапа:
7 1 января 2027 г.-31 декабря 2027 г. Молекулярно-генетические механизмы нестабильности генома и мутагенеза у животных и человека
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".